Xây dựng quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD) dùng trong đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng người

Bài viết trình bày quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xây dựng quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD) dùng trong đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng ngườiNghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ PHÂN TÁN NHIỄM SẮC CHẤT CỦA TINH TRÙNG (SPERM CHROMATIN DISPERSION - SCD) DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG NGƯỜI Nguyễn Trương Thái Hà*, Nguyễn Thị Thúy An*, Mã Phạm Quế Mai*, Phạm Nguyễn Thảo Trang*, Hồ Mạnh Tường*TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng. Đối tượng: 70 mẫu tinh dịch của tình nguyện viên nam tuổi từ 18 - 40. Phương pháp nghiên cứu: Các bước xây dựng quy trình gồm khảo sát: mật độ tinh trùng làm tiêu bản,thành phần dung dịch ly giải, thời gian ly giải và điều kiện biến tính trước ly giải. Mẫu tinh dịch xử lý H2O2 2%làm chứng dương. Hiệu quả của quy trình sẽ được đối chứng với kết quả từ bộ thuốc thử Halosperm® G2. Kết quả: Quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD)thực hiện với mật độ tinh trùng dùng làm tiêu bản là 106 tinh trùng/ml, sử dụng dung dịch biến tính là HCl0.08N, một dung dịch ly giải gồm Tris 0.4M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5M, SDS 1%, EDTA 50mM, pH 7.5, thuốcnhuộm là DAPI 2µg/ml. Hiệu quả của quy trình cho kết quả tương quan dương mạnh (r = 0.97, p < 0.01) khichạy thống kê SPSS ver.16 với bộ thuốc thử thương mại Halosperm®. Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiệnngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu vềphân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam. Từ khóa: Halosperm, hỗ trợ sinh sản, SCD, phân mảnh DNA tinh trùng, vô sinh nam.SUMMARY ESTABLISHING THE PROCEDURE SPERM CHROMATIN DISPERSION (SCD) FOR DETERMINATION OF HUMAN SPERM DNA FRAGMENTATION Nguyen Truong Thai Ha, Nguyen Thi Thuy An, Ma Pham Que Mai, Pham Nguyen Thao Trang, Ho Manh Tuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - No 5 - 2016: 82 - 87 Objective: Establish the procedure for determination of human sperm DNA fragmentation Subjects: 70 semens from male volunteers in ages 18 - 40. Methods: The experiments were surveyed such as the optimal semen dilution for templates, semen dilution,the concentration of the components in the lysis solution and conditions for human sperm DNA treatment. TheH2O2 2% treated semen was used as positive control. In addition, DFI was evaluated by both of the establishedprocedure and the halo sperm G2 kit in order to assess correlation between two methods. Result: It is shown that the optimal sperm concentration is 106 sperm/ml. Samples should be treated in thedenaturing solution HCl 0.08N before using lysis solution (Tris 0.4 M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5 M, SDS 1 %,EDTA 50 mM, pH 7.5). Sperm DNA was stained by fluorescence dye DAPI 2 µg/ml. And DFI can be analyzedon fluorescence microscopy at 40X. The strong positive correlation was observed to both of the improved SCD testand Halosperm kit (r=0.97, P50% ở cả 3 nhóm DFI. Ở nồng độ 0.4 mM và 0.6 mM kết quả DFI của mẫu tương đương vớiKhảo sát nồng độ DTT tối ưu 0.2 mM, 0.4 Halosperm ở 3 nhóm DFI. Chọn nồng độ DTT mM, 0.6 mM, 0.8 Mm 0.4 mM để tiết kiệm hóa chất. Xét chứng dương: ở nồng độ 0.2 mM, 0.4 Khảo sát nồng độ NaCl tối ưu 1M, 1.5M, 2MmM và 0.6 mM các mẫu đều cho kết quả DFI100%, nồng độ 0.8mM các mẫu bị âm tính giả Xét chứng dương: ở cả ba nồng độ tất cả cácvì chỉ cho kết quả DFI < 50%. Xét kết quả DFI mẫu đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quảcủa các mẫu: ở nồng độ 0.2 mM kết quả từ quy DFI của các mẫu: ở nồng độ NaCl 1 M kết quả 85Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016từ quy trình SCD của mẫu bị dương tính giả, tỷ 37oC trộn đều và nhỏ toàn bộ lên lam kính, đậylệ DFI >50% ở cả 3 nhóm DFI, nồng độ 1.5 M và phiến kính 24 x 60 mm lên trên để gel dàn đều.2 M các mẫu đều cho kết quả tương đương Đặt lam mẫu vào tủ 4oC trong 5 phút. Tháo bỏgiữa quy trình SCD và Haosperm. Để tiết kiệm phiến kính. Ngâm lam mẫu vào dung dịch HClhóa chất chọn nồng độ NaCl tối ưu là 1.5 M. 0,08N, trong 7 phút ở nhiệt độ phòng. ChuyểnCải tiến dung dịch ly giải ...