ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP

Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là vấn đề lớn, mang tính toàn cầu trong lĩnh vực sức khỏe con người. Cơ chế kháng chủ yếu dựa trên sự biến đổi cấu trúc các PBP (Penicillin Binding Protein) mà quan trọng nhất là PBP1A, 2B, 2X mã hóa bởi các gene pbp tương ứng. Kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism – Tính đa hình trong cấu hình mạch đơn của nucleic acid) là một trong những kỹ thuật thông dụng cho phép phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên một trình tự nucleic acid khi so...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP (SINGLE STRANDCONFORMATION POLYMORPHISM) ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN PBP2B Ở CÁC CHỦNG STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KHÁNG PENICILLIN Tóm tắt Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là vấn đề lớn, mang tínhtoàn cầu trong lĩnh vực sức khỏe con người. Cơ chế kháng chủ yếu dựa trênsự biến đổi cấu trúc các PBP (Penicillin Binding Protein) mà quan trọng nhấtlà PBP1A, 2B, 2X mã hóa bởi các gene pbp tương ứng. Kỹ thuật SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism – Tính đa hình trong cấu hìnhmạch đơn của nucleic acid) là một trong những kỹ thuật thông dụng chophép phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên một trình tự nucleic acidkhi so sánh với trình tự chuẩn (không mang đột biến). Đề tài áp dụng kỹthuật SSCP để phát hiện đột biến trên 3 trình tự của gene pbp2b ở các chủngS. pneumoniae kháng penicillin. Trước hết, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu của kỹ thuật để đạt độphân tích tốt nhất cho các trình tự đã nêu. Các chỉ tiêu này bao gồm: tácnhân biến tính, hàm lượng DNA, nồng độ gel polyacrylamide, phương phápnhuộm). Sau đó áp dụng quy trình với các chỉ tiêu đã xác định được để pháthiện đột biến trên 20 chủng kháng penicillin so sánh với chủng nhạy. Kếtquả cho thấy 18/20 chủng khảo sát có mang đột biến ít nhất trên 1 trong 3trình tự. Hai chủng kháng còn lại không cho thấy có sự khác biệt với chủngnhạy, có thể do đột biến nằm ngoài khu vực khảo sát hoặc do độ nhạy của kỹthuật. Summary USING SSCP (SINGLE S TRAND CONFORMATIONPOLYMORPHISM) TECHNIQUE FOR DETECTION OF MUTATIONOF PENICILLIN-RESISTANT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAEPBP2B GENE Đỗ Thanh Ngân, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Võ Thị Chi Mai * Y HocTP. Ho Chi Minh * Vol. 6 - No 2 - 2002: 70 - 73 1 Cử nhân Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên. 2 Tiến sĩ, bộ môn Vi sinh-Sinh học Phân tử, Đại học Khoa học Tựnhiên. 3 Tiến sĩ, bộ môn Vi sinh Khoa Y, khoa Vi sinh bệnh viện Chợ Rẫy. The spread of penicillin resistant strains of Streptococcuspneumoniae is an important worldwide health problem. Resistance isessentially based on the modification of PBPs (Penicillin Binding Proteins),particularly PBP1A, 2B and 2X, encoded by corresponding pbp genes.SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) electrophoresis analysisis one of well-known techniques used to detect point mutations in DNAfragments. We used SSCP analysis for the detection of point mutations in 3amplified fragments from pbp2b gene of resistant S. pneumoniae strains. Firstly, we determined some technical conditions of the SSCPprotocol, including denaturation agents, DNA quantity, polyacrylamide gelconcentration and staining procedure, to optimize the analysis ofinvestigated fragments. The protocol set up is used to detect point mutationsin 20 penicillin-resistant strains in comparison with the sensitive one.Results obtained showed the probable presence of point mutations in at least1 of the 3 fragments of 18/20 strains studied. The remaining 2 resistantstrains showed no difference in the electrophoretic pattern in comparisonwith the sensitive one, possibly due to the sensitivity of SSCP technique orto the absence of mutations in investigated region of pbp2b. MỞ ĐẦU Sự phát triển và lan truyền của Streptococcus pneumoniae khángpenicillin là một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe trênthế giới. Tại Việt Nam, năm 1999, theo số liệu của chương trình Giám sátquốc gia về tính kháng thuốc của một số vi khuẩn thường gặp, có 13,7%chủng S. pneumoniae được xác định là kháng penicillin (trên 153 chủngkhảo sát). Tỷ lệ này là con số đáng báo động(4). Tình hình kháng thuốc củamột số vi khuẩn ở người khỏe mạnh tại cộng đồng năm 1999 (tại ba địađiểm ngoại thành thành phố Hà Nội, Huế và TP. Hồ Chí Minh) cho thấy tỉ lệmang vi khuẩn S. pneumoniae có độc lực ở người khỏe mạnh là 40,1% tạiHà Nội, 16,7% tại Huế và 30,9% tại Tp. Hồ Chí Minh. Mức độ nhạy cảmvới penicillin của 153 chủng S. pneumoniae ở trẻ khỏe mạnh đã giảm đi19,6% tính chung cho ba địa phương này(4). Nguyên nhân kháng penicillin ở S. pneumoniae là do sự thay đổi củacác PBP (penicillin binding protein – phức hợp enzym acyl serinetransferase xúc tác tạo các cầu peptide trong hình thành thành tế bào)(3). Ởcác chủng S. pneumoniae kháng penicillin, các PBP 1A, 2A, 2B và 2X là cácPBP có khả năng thay đổi giảm ái lực với penicillin. Trong đó, sự thay đổicủa PBP 2B có vai trò quan trọng. Hơn nữa, gene pbp2b mã hóa cho PBP 2Bcó tần số đột biến rất cao và đột biến xảy ra trên gene pbp2b cũng rất đadạng(1,2,3). Trong các phương pháp phát hiện sự tồn tại các đột biến trên một trìnhtự DNA như: DGGE (Denaturing ...