Giáo trình DNA tái tổ hợp part 10

Sàng lọc các khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp. Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát hiện protein dung hợp được tiến hành như sau: Nuôi cấy qua đêm ở 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩn lạc trong môi trường LB có chứa ampicillin. Sau đó, cảm ứng nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR và tiếp tục nuôi ở 37 oC, đối với vector pEX thì chuyển nuôi cấy 37oC lên nhiệt độ 40oC và tiếp tục nuôi cấy (có sục khí)....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình DNA tái tổ hợp part 10sau đó cắt bằng enzyme hạn chế thích hợp và điện di kiểm tra trên agarosegel. Sàng lọc các khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp. Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát hiện protein dung hợp đượctiến hành như sau: Nuôi cấy qua đêm ở 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩnlạc trong môi trường LB có chứa ampicillin. Sau đó, cảm ứng nuôi cấy bằngcách bổ sung thêm isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR vàtiếp tục nuôi ở 37 oC, đối với vector pEX thì chuyển nuôi cấy 37oC lên nhiệtđộ 40oC và tiếp tục nuôi cấy (có sục khí). Sau các khoảng thời gian nuôi cấykhác nhau (1, 2, 3 và 4 giờ…), lấy 1 mL dịch nuôi cấy ly tâm nhanh để thutiểu thể, tái huyền phù chúng trong đệm 1 SDS, biến tính ở 100oC trong 3phút, ly tâm 12.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành điện di SDStrên polyacrylamide gel 6%. Dùng dịch huyền phù tế bào chỉ mang mộtmình vector làm đối chứng. Protein dung hợp sẽ xuất hiện như là một băngmới dịch chuyển chậm hơn băng β-galactosidase trong đối chứng.4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất kháng thể Protein dung hợp có thể được tách chiết theo một số cách: dùng dịchchiết urea, sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside, điện di SDS-polyacrylamide gel hoặc phối hợp giữa các cách này. Phương pháp đơn giảnnhất là điện di SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis), như trình trình bày ở mục 3 (nuôi cấy một lượng lớn trong200 mL). Nhuộm gel và phát hiện băng protein mới, sau đó cắt băng này rakhỏi gel, đông khô khoảng 2 ngày rồi nghiền thành bột mịn. Bột này sẽ đượcdùng tiêm vào thỏ để sản xuất kháng thể.II. Sản xuất các protein nguyên thể Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E. coli bằng cáchsử dụng promoter điều hòa mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả.Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh chỉ cần cungcấp một promoter là đủ. Trong khi đó, để biểu hiện một gen eukaryote (hoặcmột gen prokaryote với một trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cungcấp cả promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4). Các mức độ biểuhiện có thể khác nhau từ dưới 1% cho tới hơn 30% protein hòa tan tổng số(total soluble protein) của tế bào. 160Công nghệ DNA tái tổ hợp Promoter Gen A ATG DNA SD ATG mRNA SD Met Protein nguyên thể N CHình 7.4. Protein nguyên thể. Gen tạo dòng (gen A) được đặt sau promoter vàtrình tự SD của vi khuẩn. mRNA chỉ mã hóa các amino acid đặc hiệu của đoạnchèn để tạo ra loại protein nguyên thể.  Biểu hiện của các gen ở prokaryote: Promoter Bước đầu tiên khi biểu hiện các protein của eukaryote trong vi khuẩnlà chọn một vector biểu hiện mang promoter mạnh (strong promoter) trình tự DNA h (còn gọi là vùng 5’ khôngdịch mã-5’ untranslation region)t . E. coli hòa (toxin) E.coli củaplasmid. Phần này giới thiệu các vector biểu hiện mang promoter PL củabacteriophage , promoter (lai) trp-lac và promoter bacteriophage T7.1. Promoter PL Promoter PL (31oC), promoter PL 161Công nghệ DNA tái tổ hợpcủa gen c L L của như: pPLa 2311, pPLa 8 và pKC30. EcoRI 0 HindIII 6000 1000 r Amp PL PL nutL HpaI N pKC30 (6,4 kb) 5000 ori 2000 tL BamHI 4000 3000Hình 7.5. Vector pKC30. pKC30 là plasmid có kích thước xấp xỉ 6,4 kb, mangpromoter PL của bacteriophage và vị trí nhận biết HpaI nằm ở vùng cùnghướng (có 321 nucleotides) với vị trí khởi đầu phiên mã của P L. Plasmid này làdạng phân chia của vector pBR322 và chứa đoạn HindIII-BamHI có nguồn gốctừ bacteriophage được chèn vào giữa c ác vị trí HindIII và BamHI của vector.Đoạn chèn cDNA mang tín hiệu promoter (P L), một vị trí được nhận biết bởi sảnphẩm của gen N (nutL), bản thân gen N, và tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộcrho (tL). Vị trí nhận biết HpaI nằm với vùng mã hóa của gen N. Các trình tựDNA được chèn vào trong vị trí HpaI có thể được điều chỉnh bằng cách chuyểnpla ...