Giáo trình DNA tái tổ hợp part 4

(anchored PCR), kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tự nucleotide ở một đầu của khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo (ví dụ: dA) kia (chưa biết trình tự). Sau đó đoạn oligo(dT) (Hình 3.5). (inverse PCR), đ với đoạn hạn chế nhờ enzyme DNA ligase đoạn đã 3.6).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình DNA tái tổ hợp part 4 thông dụng . Trong (standard PCR), DNA 4 loại deoxyribonucleotide (Hình 3.4). Taq pol PA DNA khuôn mẫu Biến tính Taq polymerase PB (PA) và (PB) là các primer đặc hiệu Hình 3.4. Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn (anchored PCR), kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tựnucleotide ở một đầu của khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo(ví dụ: dA) kia (chưa biết trình tự). Sau đó đoạnoligo(dT) (Hình 3.5). (inverse PCR), đ các với đoạnhạn chế nhờ enzyme DNA ligase đoạn hai p đã 3.6).II. Quy trình PCR - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - 2 primer (F và R) 52 - Taq pol - 4 loại dNTP - Đệm và các muối khoáng X N1 N2 5’ 3’ 3’ 5’ DNA khuôn mẫu X: trình tự đã biết; N1 và N2: trình tự chưa biết X N1 N2 A Khuếch đại PCR bằng primer đặc hiệu của trình tự đã biết (PX) và primer đặc hiệu của chuỗi neo (PA) X N1 N2 PA Px A Hình 3.5. Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo2. Thực hiện phản ứng a : eppendorf tube (E-tube) loại0,5 mL, trộn đều các thành phần sau: Đệm 10 PCR 4,5 L Hỗn h ) 4L Primer-F (10 pmol/ L) 2,5 L Primer-R (10 pmol/ L) 2,5 L Thêm H2 40 L 53 Taq pol: 10 2L Taq pol (5 units/ L) 1L Thêm H2 20 L DNA đã biết Enzyme hạn chế Enzyme hạn chế Y X 5’ 3’ 5’ 3’ Tạo vòng bằng DNA ligase PCR Y X 3.6. Sơ đồ ược2.3. Bổ sung 5 L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 L dung dịch củamaster mix tube. 2 Taq pol.2.5. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCRđể thực hiện chế độ nhiệt theo chu kỳ như sau: 54 - Start program - 95oC/5 phút : 95oC/30 giây, 50o 72oC/1 phút - - 72oC/10 phút 4oC - - Chạy điện di để h 3.7) -20oC - đ ư -bằng thực tham khảo. - vàTaq pol, sau đó chia ra từng tube rồi cho DNA và Taq pol . - Thao tác trong tủ cấy vô trùng (hoặc không). SM 1 2 3 4 5 SMHình 3.7. Điện di các sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước DNA. 1, 2, 3, 4 5: Các khác nhau. ...