Giáo trình DNA tái tổ hợp part 7

Các BAC vector hiện nay được xem như công cụ hữu hiệu nhất trong việc xây dựng các thư viện genome, do chúng có các ưu điểm sau: - Có khả năng gắn các đại phân tử DNA 100-300 kb. - Ít hình thành thể khảm (chimera). - Có hiệu quả cao trong tạo dòng và thu hồi DNA. - Duy trì sự ổn định của các DNA được gắn vào vector. Nhờ những ưu điểm trên nên hệ thống BAC thường được dùng để xây dựng bản đồ vật lý. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình DNA tái tổ hợp part 7 đầu cos (chương 4 Cosmid . Sau khi đầux vào tiếpcos chèn khả năng của phage . 40-45 kb,4. Các BAC vector Các BAC vector hiện nay được xem như công cụ hữu hiệu nhất trongviệc xây dựng các thư viện genome, do chúng có các ưu điểm sau: - Có khả năng gắn các đại phân tử DNA 100-300 kb. - Ít hình thành thể khảm (chimera). - Có hiệu quả cao trong tạo dòng và thu hồi DNA. - Duy trì sự ổn định của các DNA được gắn vào vector. Nhờ những ưu điểm trên nên hệ thống BAC thường được dùng để xâydựng bản đồ vật lý. DNA có thể dễ dàng được phân lập trong các dòngBAC, các dòng phân lập được từ lai khuẩn lạc sẽ được kiểm tra bằng kỹthuật DNA fingerprinting thông qua phản ứng cắt của enzyme hạn chếHindIII. Kỹ thuật fingerprinting cung cấp cho chúng ta thông tin về nhữngphần trùng lặp (overlapping) và không trùng lặp của BAC. Nhờ vậy, có thểhoàn thiện bản đồ vật lý có chất lượng cao, phục vụ cho việc phân tíchgenome và chuyển nạp gen sau này.5. Các YAC vector Các YAC là các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và cũng là cácvector tạo dòng được sử dụng trong phân tích genome. Chúng mang cácđoạn telomere (phần cuối) và centromere (phần tâm) của một nhiễm sắc thểtrong nấm men. Cả hai nhân tố này cần thiết cho sự tái bản của nhiễm sắcthể trong các tế bào nấm men: nếu không có telomere, thì sau đó các đầucủa nhiễm sắc thể có khả năng bị rời ra hoặc gắn vào các nhiễm sắc thểkhác. Nếu không có centromere, thì sau đó các nhiễm sắc thể mới được tạoCông nghệ DNA tái tổ hợp 106thành sẽ không được đẩy vào trong các tế bào mới của quá trình phân chia tếbào. Ngoài ra, còn phải có một gốc tái bản để sao chép DNA. Các nhân tố này được đặt trong một đoạn DNA đơn, được dùng nhưmột vector để tạo dòng DNA ngoại lai ở trong nấm men. Ưu điểm của YAClà có thể nhận các đoạn DNA có kích thước lớn. Như vậy, trong khi tạodòng vi khuẩn theo phương pháp truyền thống bằng cách dùngbacteriophage hoặc các plasmid thường bị giới hạn bởi kích thước của cácđoạn DNA được tạo dòng (chỉ vài chục kilobase), thì các YAC có thể tạodòng các đoạn DNA dài hàng ngàn kilobase. Điều này giúp cho việc lập bảnđồ genome hoàn chỉnh dễ dàng hơn nhiều. Nhược điểm của các YAC đó là kỹ thuật thao tác còn nhiều khó khăn,và một vấn đề chung là DNA từ hai vùng khác nhau của genome gốc có thểkết thúc trong một YAC, dẫn đến xuất hiện sự liên kết sai mà kết quả là tạora một dòng khảm.III. Đóng gói in vitro DNA tái tổ hợp và xâm nhiễm vào tế bào vậtchủ Trường hợp sử dụng vector mang gen ngoại lai là bacteriophage λhoặc cosmid để xây dựng thư viện genome, thì thể tái tổ hợp trần (nakedrecombinant) của các loại vector này không thể chuyển vào trong vi khuẩnđược. Do đó, người ta cần phải đóng gói in vitro DNA của chúng trong mộtđầu rỗng của phage λ, rồi sau đó mới cho chúng xâm nhiễm vào các tế bàovi khuẩn. Nguyên lý của sự đóng gói in vitro (in vitro packaging) là nhờ vào khảnăng mang các đầu cos của phage λ ở hai đầu 5’ và 3’ của các vector tái tổhợp để đóng gói chúng khi có mặt các đầu rỗng của phage và các proteinđóng gói. Phương thức này đòi hỏi các phân tử vector tái tổ hợp phải cóchiều dài ít nhất là 38 kb và không được lớn hơn 52 kb. Các đầu phage đượcđóng gói sẽ hoàn thiện trong các tiểu thể phage xâm nhiễm in vitro khi cómặt các sản phẩm của các gen W và FII, và các đuôi của phage. Tất cảprotein cần thiết cho đóng gói có thể thu được từ các chủng E. coliBHB2688 và BHB2690. Các hỗn hợp đóng gói chỉ cần chuẩn bị một lần vàcó thể bảo quản ở -80oC.Công nghệ DNA tái tổ hợp 107 Tùy thuộc vào loại vector mà có thể dùng một lượng thích hợp chủngE. coli cho việc xâm nhiễm. Các chủng này được cho “đói” (starve) trướckhi sử dụng, hoặc bằng cách sinh trưởng trên môi trường tối thiểu và sau đóxử lý với dung dịch CaCl2 0,1 M, hoặc bằng cách rửa trong dung dịch CaCl20,1 M sau khi nhân lên trong môi trường LB1. Phương thức xử lý này cảmứng sự tổng hợp các λ receptor (protein lamB) trên bề mặt tế bào và tăngđáng kể sự hấp thụ phage vào các tế bào E. coli. Các tiểu thể phage xâmnhiễm, thu được khi có mặt các protein phage và các hợp phần của đuôiphage, sẽ được dùng để xâm nhiễm các vi khuẩn mẫn cảm (susceptiblebacteria). Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc trên cơ sở tính kháng khángsinh của chúng và sau đó có thể được khuếch đại tiếp. Sự xâm nhiễm được thực hiện bằng cách ủ hỗn hợp các tiểu thể phagexâm nhiễm thu được sau khi đóng gói in vitr ...