Giáo trình DNA tái tổ hợp part 8

2. Phương pháp enzyme Sanger Đây là phương pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi (chain terminator method). Nguyên lý của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp DNA. Do đó, khi DNA polymerase gắn chúng vào sợi DNA thì quá trình tổng hợp bị ngừng lại. Vì vậy, phương pháp này còn gọi là phương pháp dideoxy (dideoxy method). Đầu tiên sợi đôi DNA (sợi khuôn cần đọc trình tự) bị biến tính tách thành hai sợi đơn và được lai với primer. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình DNA tái tổ hợp part 82. Phương pháp enzyme Sanger Đây là phương pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi (chain terminatormethod). Nguyên lý của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide khôngcó nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp DNA. Do đó, khi DNApolymerase gắn chúng vào sợi DNA thì quá trình tổng hợp bị ngừng lại. Vìvậy, phương pháp này còn gọi là phương pháp dideoxy (dideoxy method). Đầu tiên sợi đôi DNA (sợi khuôn cần đọc trình tự) bị biến tính táchthành hai sợi đơn và được lai với primer. Primer là một sợi đơn gồm vàichục nucleotide có thể liên kết với một trong hai sợi đơn DNA theo nguyêntắc tạo cặp bổ sung. Sau đó, bốn phản ứng riêng rẽ được tiến hành đồngthời. Mỗi phản ứng là hỗn hợp của DNA khuôn mẫu, primer, DNApolymerase, một loại dideoxynucleotide và bốn loại deoxynucleotide theo tỷlệ 1:100. Các sợi đơn DNA được tổng hợp có độ dài khác nhau dodideoxynucleotide gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Sản phẩm của bốnphản ứng cùng được phân ly trên polyacrylamide gel cho phép phân biệt haisợi đơn DNA hơn kém nhau một nucleotide. Các vạch DNA quan sát đượcnhờ có gắn phóng xạ 32P vào mồi hoặc vào một trong bốn loại loạinucleotide bình thường (Hình 5.13).3. Xác định trình tự nucleotide trên máy tự động Trong những năm gần đây, một số phương pháp xác định trình tự mớiđã xuất hiện. Bên cạnh kỹ thuật thông thường sử dụng các gel để phân lycác phân tử DNA có độ dài khác nhau, các kỹ thuật mới liên quan đến pháthiện huỳnh quang của các nucleotide được đánh dấu, phân tích trình tựDNA bằng khối phổ, điện di mao quản hoặc lai với các đoạnoligonucleotide được tổng hợp nhân tạo. Những tiến bộ nhanh chóng tronglĩnh vực kính hiển vi điện tử cho phép quan sát chi tiết cấu trúc bề mặt củaphân tử nucleic acid và phân biệt từng nucleotide. Ngoài ra, kỹ thuật lai sửdụng tấm chip gắn cố định các oligonucleotide cho phép phân biệt được hơn50.000 phân tử DNA khác nhau. Trong tương lai gần, kỹ thuật lai này có thểgắn hàng nghìn oligo trên một tấm chip nhỏ và trình tự nucleotide đượcphân tích tự động bằng các chương trình của computer. Điều đó cho phépxác định trình tự một cách nhanh chóng.Công nghệ DNA tái tổ hợp 124 5’ GCATATGTCAGTCCAG 3’ DNA sợi đôi 3’ CGTATACAGTCAGGTC 5’ Biến tính nhiệt và gắn primer 3’ CGTATACAGTCAGGTC 5’ DNA polymerase P-GCAT-OH dNTPs ddATP ddTTP ddCTP ddGTP P- GCATAT P- GCATATC P- GCATATCG P- GCATA P- GCATATGCTAT P- GCATATGCTATC P- GCATATGCTATCG P- GCATATGCTA P- GCATATGCTAGTCCA P- GCATATGCTAGTCCAT P- GCATATGCTAGTCCATC P- GCATATGCTAGTCCATG 3’ 5’ A T C GHình 5.13. Xác định trình tự nucleotide bằng phương pháp enzyme (Sanger).Dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) gắn vào sợi DNA đang tổng hợp sẽlàm ngừng phản ứng. Nhờ đó thu được các đoạn DNA hơn kém nhau chỉ mộtnucleotide. Các đoạn này được quan sát trên polyacrylamide gel khi primer đượcđánh dấu phóng xạ 32P hoặc đánh dấu huỳnh quang. Phương pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi được cải tiến cho phép xácđịnh trình tự trên máy đọc tự động (automatic sequencer), sử dụng các bộCông nghệ DNA tái tổ hợp 125Kit khác nhau, trong đó đầu tận cùng được đánh dấu bằng các chất pháthuỳnh quang màu (dye terminator). Phản ứng gắn các nucleotide đánh dấuvào sợi DNA tổng hợp trên khuôn mẫu được tiến hành trong máy PCR. Vìvậy, kỹ thuật này còn được gọi là phản ứng chuỗi đọc trình tự. Sau đó, sảnphẩm PCR được điện di trên polyacrylamide gel có độ phân giải cao, chophép phân biệt được các sợi đơn DNA hơn kém nhau một nucleotide. Quátrình chạy điện di được thực hiện trên máy tự động và kết quả được phântích bằng các chương trình computer chuyên dụng (Hình 5.14). Trên các máy đọc tự động hiện đại, thông thường bốn loại nucleotideđược đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc lasertrong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu,mỗi màu ứng với một loại nucleotide và được hiển thị bằng một đỉnh.Thông thường, phản ứng gắn nucleotide vào sợi DNA tổng hợp trên sợikhuôn mẫu được thực hiện bằng PCR. Hai loại nucleotide dGTP và dTTPđược thay thế bằng dITP và dUTP nhằm hạn chế sự trùng lặp các đỉnh. Sảnphẩm PCR thường được tinh sạch, loại bỏ các nucleotide và primer thừatrước khi đưa vào máy đọc tự độn ...