Luận văn: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA (part 3)

Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-800C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là được. 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocelluloseMàng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai). 3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA (part 3) 26 Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-800C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các - góc màng co lại là được. 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocellulose Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENELINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của mànghướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại tronghộp kín cho đến khi tiến hành lai). 3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 550C, đồngthời làm nóng dung dịch đệm lai ở 550C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thôngsố sau: Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng) Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)  Qui trình thực hiện phản ứng lai Bước 1: Tiền lai Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 550C và dung dịch đệm lai cũng đãđược làm nóng đến 550C, tiến hành rửa ống lai bằng nước cất vô trùng, sau đó bơmvào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề khôngcó DNA tiếp xúc với thành ống lai. Thời gian cho bước này là 15 phút. Bước 2: Lai Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai(tránh nhỏ trực tiếp lên màng), phản ứng được thực hiện trong một thời gian dài, có thểđể phản ứng qua đêm là phù hợp nhất (12 giờ). 3.5.5.2. Rửa màng nitrocellulose sau khi lai Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến550C. Thực hiện rửa màng theo các bước sau: 27 Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1. - Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống như khi lai, thời gian rửa là 10 phút. Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút. - Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch - với bề có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Lặp lại bước trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể được giữ trong dung - dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát hiện. 3.5.5.3. Phát hiện kết quả bắt cặp giữa probe và đoạn DNA đích bằng huỳnh quang và thể hiện trên X-ray phim  Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất pháthiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau: Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp - khăn giấy. Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran - wrap với bề có DNA hướng lên trên. Hút 1000 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng. - Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện - bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí. Sau đó, màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với - kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô).  Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim trong cassette Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thờigian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từkhi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng pháthiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối. 28 Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏicassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâmtrong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạchvà dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. Giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn tuy dễ thực hiện nhưng không đơngiản. Để có thể triết tách được một lượng DNA tốt và có thể sử dụng cho nhữngnghiên cứu sau này, thì ngoài phương pháp cần phải có một kinh nghiệm trong thaotác. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng đầu tiên cho phép phản ứng lai thành cônghay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lượng DNA có trong mẫu và lượng DNAphải đủ lớn để có thể phát hiện được qua lai với probe. Các thao tác phải nhẹ nhàng đểtránh DNA bị gãy. Kết quả tách chiết có ý nghĩa cao là phải đảm bảo độ tinh khiết caokhông còn hóa chất ly trích sót lại. Sau khi tiến hành tách chiết DNA theo đúng qui trình, chúng tôi thu được lượngDNA của các mẫu như sau: 29 CT80 LA9 CT178 AG518 TG24 CT72 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT74 CT64 KG398 KG531 CT63 LA2 CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531 Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea.Nấm sau khi nuôi cấy trong máy lắc định ôn 370C, qua 72 giờ được ly trích DNA,DNA sau ly trích được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X,hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút. Kết quả điện di trong hình 4.1 cho thấy, tất cả các ...