Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ part 2

Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8 juice, cà rốt agar, lima bean agar. Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora. Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài P....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ part 2 11 Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8juice, cà rốt agar, lima bean agar. Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình tháiđặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộphận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trườngnuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora. Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loàiP. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sựhiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấmxòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môitrường nuôi cấy. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải làgiải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth vàIrwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồngthời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh họcphân tử. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và địnhdanh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic,Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection ofSoilborne Plant-Pathogenic Fungi)2.3.2. So sánh sự tương đồng về sinh sản và sinh dưỡng Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác địnhvà mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuậtso sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểuquần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau khôngnhiều về di truyền và cơ chế. Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khókhăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trườngthuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhaucủa các loài định sẵn có thể không có giá trị; một số cá thể trong quần thể nấm có thểkhông có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kì những chủngkiểm tra đã biết. 12 So sánh về sinh dưỡng, hay thể dị hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm vềmối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựavào khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau, nó rất giống với sự đánhgiá những đặc điểm di truyền khác. Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trongcác loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ).2.3.3. Kỹ thuật protein profile Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài. Kỹ thuật nàybao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gelpolyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách. Kỹthuật này được áp dụng trên nhiều giống nấm bệnh có nguồn gốc từ đất (soilborne).2.3.4. Isozymes Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong cácmẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi córất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Cácenzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetatecơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữaenzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiệndiện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể t hay đổitrong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của nhữngenzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vậtnhư tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịchnhuộm,và chuẩn bị mẫu. Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gianchuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh cónguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụngđể sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cầnphải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, cácprotein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải 13với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nềnlà mô cây hay đất. Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán v à phát hiệnở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay cácchủng đặc biệt. Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vàokỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sựcần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cầnthiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệtnấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán vànghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản líbệnh.2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn được phân cắt (RFLP) Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng đểxác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: lytrích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt cácđo ...