Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ part 3

Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai(1) và (3) PCR mẫu DL1 ở nồng độ 30ng và 10ng (2) và (4) PCR mẫu DL2 ở nồng độ 30ng và 10ngỞ hai mẫu một và hai là sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan với nồng độ 30ng. Trong khi hai mẫu còn lại là kết quả thu được khi chạy PCR hai mẫu trên với nồng độ 10ng. Chúng tôi tạm thời không thể giải thích rõ ràng kết quả trên tuy nhiên nó cho ta thấy nồng độ DNA mẫu cũng quyết định kết quả...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ part 3 32 900bp Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai (1) và (3) PCR mẫu DL1 ở nồng độ 30ng và 10ng (2) và (4) PCR mẫu DL2 ở nồng độ 30ng và 10ng Ở hai mẫu một và hai là sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lanvới nồng độ 30ng. Trong khi hai mẫu còn lại là kết quả thu được khi chạy PCR haimẫu trên với nồng độ 10ng. Chúng tôi tạm thời không thể giải thích rõ ràng kết quả trên tuy nhiên nó cho tathấy nồng độ DNA mẫu cũng quyết định kết quả PCR.. Ở nồng độ 30ng mẫu chỉ chora sản phẩm là một band DNA duy nhất chứng tỏ mẫu DNA ly trích là mẫu tinh sạchkhông tạp nhiểm với DNA của bất kì một loài nào khác. Sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan ở nồng độ 10ng cho haiband rõ ràng, độ sáng như nhau. Kích thước hai band này chênh lệch nhau khoảng100bp. Chúng tôi có thể giải thích kết quả trên như sau: thứ nhất nguyên nhân này cóthể là do hai mẫu nấm này đã bị tạp nhiễm trong quá trình pha loãng ở nồng độ 10 ngcho nên sản phẩm PCR ở nồng độ 10 ng cho ra hai band khác; thứ hai do quá trình phaloãng không đáng tin cậy. Sản phẩm pha loãng ở 10 ng có nồng độ cao hơn sản phẩmpha loãng ở 30 ng và kích thước đoạn trình tự này có vùng lập lại cho nên trong điềukiện nhất định cặp mồi ITS4 – ITS5 có thể bắt cặp ở nhiều vị trí khác nhau và cho rasản phẩm PCR có đến hai hay ba band khác nhau trên cùng một vùng trình tự, cácband này có độ sáng như nhau. 33 Như vậy, kết quả chạy PCR ở trên không thể định danh được hai mẫuPhytophthora. Để định danh được hai mẫu nấm trên, chúng tôi đã tiến hành tinh sạchsản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự chúng một cách chính xác hơn.4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Tinh sạch sản phẩm PCR dùng để giải trình tự cũng nhằm mục đích như tinhsạch mẫu DNA dùng cho phản ứng PCR. Cả hai nguyên tắc tinh sạch này là như nhaunhưng với qui trình tinh sạch để giải trình tự đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm ngặthơn. Bởi vì qui trình này phải đảm bảo độ tinh sạch của sản phẩm PCR là tối ưu nhấtđủ để thực hiện phương pháp giải trình tự bằng máy giải trình tự trực tiếp. Qui trình tinh sạch được chúng tôi đề nghị thực hiện theo hai phương pháp khác nhau: - Phương pháp tinh sạch bằng thao tác tay: phương pháp này thựchiện khá đơn giản, ta có thể sử dụng các hoá chất dùng cho tinh sạch mẫu DNA lytrích để tinh sạch phẩm PCR với mục đích đọc trình tự. Vấn đề đòi hỏi của phươngpháp này là thao tác thực hiện phải chính xác. Do thao tác thực hiện trong quá trình tinh sạch còn kém nên. Chúng tôiđã không thu được sản phẩm tinh sạch từ phương pháp này. Nguyên nhân chính cóthể là do công đoạn tủa DNA và rửa DNA bằng ethanol không đạt hiệu quả làm mất đisản phẩm khuếch đại. - Phương pháp tinh sạch bằng cột GFX: Đây là phương pháp tinh sạchbằng kit; thao tác thực hiện đơn giản, nhanh và cho sản phẩm tinh sạch với nồng độcao. DNA của hai mẫu nấm Phytophthora trên địa lan trước khi được tinhsạch bằng cột phải được chạy điện di và thông qua công đoạn cắt gel để đảm bảo độtinh sạch cho sản phẩm. Tuy nhiên, ta cũng nên lưu ý một số điểm sau: công đoạn cắtgel đòi hỏi phải chính xác cắt dúng vị trí band DNA trên gel; công đoạn dùng hoá chấtphải nhỏ chính xác giữa cột ,... 34 900bp Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự (1) Sản phẩm PCR của DL1; (2) Sản phẩm PCR của DL24.5 Xử lý kết quả giải trình tự Đoạn gen khuếch đại được giải trình tự bằng máy đọc trình tự ABI PRISM3100. Chúng tôi đã thu được trình tự hai mẫu nấm này trên hai chiều ( xuôi và ngược)phản ứng của kỹ thuật giải trình tự. Độ dài mỗi đoạn trình tự trên hai chiều xuôi vàngược của phản ứng khoảng 840- 850 bp. Để đơn giản cho quá trình so sánh trình tựvới các loài nấm khác, chúng tôi chỉ chọn trình tự hai mẫu DL1, DL2 trên mồi ITS5.4.5.1. Trình tự mẫu DL1 TTANGAAGAGGNAGGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCC CTTTAGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCG TGCTGGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGT TTTAAACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTA GATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACT GCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGC ACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTT CTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTT CGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGC GTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTA CGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCT TATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTT GGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTC GATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAG GCAAGATTAC4.5.2. Trình tự mẫu DL2 GACTGCGGAAGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTT AGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCT GGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTA 35 AACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATA GCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGA TACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTT CCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCG ...