Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 5

27 3.5. Đánh giá 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) Mục đích Tìm hiểu khả năng sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch để xác định kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Chuẩn bị thạch 1,5 g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. Chuẩn bị mẫu Mẫu huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. Mẫu...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 5 273.5. Đánh giá 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) Mục đích Tìm hiểu khả năng sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch để xác định kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Chuẩn bị thạch 1,5 g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. Chuẩn bị mẫu - Mẫu huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. - Mẫu kháng huyết thanh chưa pha loãng. - Mẫu protein tái tổ hợp MBP-VT2eB nồng độ 1,588 mg/ml được pha loãng theo tỉ lệ ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32. - Mẫu kháng huyết thanh được pha loãng theo tỉ lệ ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32. Thực hiện – đánh giá Hút kháng nguyên và kháng thể vào các giếng tương ứng, đặt thạch vào buồng ẩm ở 4oC. Khoảng 24 – 48g sau quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. Đường tủa (a) (b) Hình 3.2: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) Phản ứng (+): xuất hiện đường tủa ở một trong hai trường hợp (a hoặc b). Phản ứng (-): không xuất hiện đường tủa ở cả hai trường hợp a và b. 283.5.2. Định lượng: Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 3.5.2.1. Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) Chuẩn bị độc tố VT2e Vi khuẩn E. coli 0139 K82 (H28) có gen quy định độc tố VT2e được nuôi cấy trong môi trường LB, ở 37oC, lắc 150 vòng/phút trong 24g. Dịch nuôi cấy đem ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút. Thu dịch trong để thử độc tố trên tế bào vero. Chuẩn bị tế bào vero Tế bào vero được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), 2 mM gentamycin trong các chai nuôi cấy 25 cm2, ở 37oC, 5%CO2. Các tế bào được chuyển vào phiến 96 giếng theo các bước sau - Đổ bỏ môi trường trong chai. - Hút 3,5 ml versene 0,2% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trong versene có EDTA sẽ làm phân tách tế bào. - Hút 2,5 ml trypsin 0,5% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trypsin sẽ loại bỏ protein có trong môi trường cũ. - Sau đó cho huyết thanh bào thai bê (FBS) và môi trường DMEM vào, hút 0,2 ml đem đếm nồng độ tế bào. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ tế bào là 300.000 tế bào/ml và nồng độ huyết thanh là 10%. Hút 100 µl tế bào vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng, ủ ở 37oC, 5% - CO2 trong 24g. Xác định liều TCID50 - Đối chứng (-)1: giếng chỉ chứa môi trường nuôi cấy tế bào DMEM. Đối chứng (-)2: giếng chứa dịch lọc canh khuẩn E. coli DH5α. - 29 Dịch thu từ huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli 0139 K82 được pha loãng theo tỉ lệ ½,1/20, 1/200, 1/2000, ...Hút 100 µl dịch lọc canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trên vào mỗi giếng từ cột1 đến cột 11 trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero. Hút 100 µl dịch lọc canh cấy vikhuẩn E. coli DH5α vào 4 giếng ở cột 12 trên phiến 96 giếng làm đối chứng (-)2, 4 giếng còn lại là đối chứng (-)1 Ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24 – 48g Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược vào những thời điểm 24 –48g. Những giếng dương tính là những giếng có sự phân tách tế bào. Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định liều TCID50 Sơ đồ 3.2: Quy trình xác định liều TCID50 - Đánh giá kết quả: Nồng độ TCID50 là nồng độ gây chết 50% tế bào vero trong giếng nuôi cấy tế bào. Quan sát sự huỷ hoại tế bào do độc tố verotoxin tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm và xác định kết quả bằng phương pháp Reed – Muench. Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng (-)2. Những giếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứ ...