Luận văn : Sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli part 3

19 3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu - Dùng muỗng vô trùng lấy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bò, heo vừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 80C và chuyển về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùng tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm. - Quét bề mặt thịt bò bằng gạc hoặc tăm bông vô trùng, cho vào ống nghiệm chứa sẵn nước pepton đệm....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : Sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli part 3 193.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu - Dùng muỗng vô trùn g lấy phần giữa cục phân (kho ảng 10 -12 g) m à bò, heovừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 80C và chuyển vềphòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Phân tiêu ch ảy có thể đ ược lấy bằng cách dùngtăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm. - Quét bề mặt thịt bò bằng gạc hoặc tăm bông vô trùng, cho vào ống nghiệmchứa sẵn nước pepton đệm.3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy  Môi trường tăng sinh Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E. coli gây bệnh hiện diện trongthực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập chúng tôi sử dụng môi trường tăng sinhpepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125mg/L) và vancomycin (8mg/L)(FDA, 2002) đ ể ức chế các vi khuẩn gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác.  Môi trường phân lập Để xác định môi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập E. coli nhóm STECmang gen độc lực, chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường MAC, SMAC và CT - SMAC. Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey(SMAC), và Sorbitol MacConkey (CT - SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime(0,05mg/L) và tellurite (2,5mg/L) (FDA, 2002). Khoảng 90% E. coli đ ều lên menđường lactose, trên môi trường MAC, E. coli đ iển h ình có khuẩn lạc màu đỏ hồng.Trên môi trường SMAC và CT - SMAC, E. coli không lên men đường sorbitol nêncho khu ẩn lạc m àu trắng, những dòng E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màuhồng. Việc tầm soát E. coli n hóm STEC trên phân, bệnh phẩm trên th ạch SMAC, CT -SMAC là công cụ ban đầu phát hiện serotype O157 thuộc nhóm STEC.3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính (1) Nuôi cấy và phân lập E. coli hiện diện trong phân với số lượng lớn, nên phân heo hoặc bò sau khi thuthập và chuyển về phòng thí nghiệm đ ược tiến h ành ria trực tiếp trên môi trường thạch 20đĩa MAC và SMAC, ủ 37 0C trong 18 - 24giờ, chọn và thu khuẩn lạc điển h ình , giữgốc. Li trích DNA rồi thực hiện multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực. Riêng đối với mẫu bề mặt thịt, do lượng E. coli hiện diện trên bề mặt thịt thườngthấp so với mẫu phân, n goài ra những dòng E. coli gây bệnh hiện diện trong phân, thựcphẩm với tần số thấp hơn nhiều so với nhóm E. coli STEC không thuộc O157 (Patonvà Paton, 1998). Đây chính là trở ngại cho việc phát hiện E. coli O157:H7, nên việcphết và ria trực tiếp trên môi trường MAC, SMAC thường gặp nhiều khó khăn. Vì vậy,để cải thiện khả năng phát hiện STEC có mang gen độc lực từ thịt, sử dụng môi trườngpepton đệm có bổ sung van comycin và cefixime (PVC) nhằm hạn chế sự cạnh tranhphát triển của những vi khuẩn khác để STEC có cơ hội tăng sinh tốt hơn. Sau khi ủ370C trong 24h, canh khuẩn này được cấy ria trở lại trên môi trường thạch CT - SMACđể chọn lọc chuyên biệt nhóm STEC. (2) Chọn khuẩn lạc E. coli Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT - SMAC, ch ọn n gẫu nhiên 6 – 10khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm h ình thái: o Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC được kí hiệu HM. o Khuẩn lạc hồng hoặc trắng trên môi trường SMAC được kí hiệu lần lượt là HS hoặc TS. o Khuẩn lạc trắng hoặc hồng trên môi trường CT - SMAC kí hiệu lần lượt là TCT hoặc HCT. Dùng que cấy chạm nhẹ trên từng khuẩn lạc rời rạc rồi chuyển vào từng ống NAriêng biệt đ ể giữ gốc riêng lẻ. Thu ph ần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm, gom chungvào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 – 0 ,5 m l nước cất khử ion vô trùng. (3) Thử sinh hóa Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộcnhóm đó đ ể xác định E. coli .3.3.3. Li trích DNA Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với ý kiến của Cerna (2003) và Botteldoorn(2003), việc ly trích DNA đư ợc thực hiện như sau: thu kho ảng 6 -10 khuẩn lạc E. colitrên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC hoặc CT - SMAC hoặc NA) cho vào eppendorfđựng sẵn 0,4 - 0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chu yển vàotủ âm -700C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 21phút. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xétnghiệm). Mẫu Thịt Phân MAC SMAC Pepton (vancomycin, o (37oC/24h) c ...