Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) part 3

Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai loài virus MrNV, XSV trên mẫu tôm thịt được cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tôm bình thường được xác định bằng phương pháp mô học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) part 3 27 Tôm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ 10 Tôm mẹ ĐBSCL 8 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐUÔI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai loài virus MrNV,XSV trên mẫu tôm thịt được cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi tiến hành thực hiện đồngthời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tôm bìnhthường được xác định bằng phương pháp mô học, để xác định mức độ đặc hiệu củamồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phòng thí nghiệm của ViệnNghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tương đối giống nhau cho mẫu chứngdương, không có sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. 1 2 3 M 4 55 5 6 6XSV 500 bp 681 bp MrNV Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm. Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thường không nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. 28 Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tôm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thường không nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Mẫu tôm thịt bệnh được cung cấp từ Ấn Độ được tách chiết bằng bộ Kit có 1vạch sản phẩm có kích thước 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm có kíchthước 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed vàcộng sự. Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tôi thực hiện một mẫu tôm bìnhthường. RNA của tôm không nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5)không thấy có sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single -Step RT - PCR rất đặc hiệu. Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tôi tiến hành làm hai mẫu chứng âm(giếng 1, 6), mẫu này có đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu.Mẫu này không cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT -PCR mà chúng tôi thực hiện không bị ngoại nhiễm. Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tôi ứng dụng cho kếtquả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trước. 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết Trong phản ứng RT - PCR công đoạn tách chiết RNA được xem là mộttrong những bước quyết định. Do đó chúng tôi tiến hành hai phương pháp tách chiếtkhác nhau trên 1 mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi được cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit vàtheo phương pháp Trizol để có thể đánh giá được hiệu quả của hai phương pháp táchchiết này. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 29 1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 A B C DMrNV XSV Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dương được tách chiết bộ Kit và Trizol. Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR được tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả Virus giếng 1 giếng 2 giếng 3 MrNV ++++ Bộ Kit gi ...