Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 6

Biểu đồ 4. 1 Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nước cất. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD.Theo đường tương quan này chúng tôi nhận thấy mối tương quan giữa hai giá trị khảo sát tương đối chặt. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) mật số tế bào là 108/ml tương ứng với giá trị OD là 0.145-0.45,
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 6Biểu đồ 4. 1 Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãngtế bào bằng nước cất. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. Theo đường tương quan này chúng tôi nhận thấy mối tương quan giữa hai giá trị khảo sáttương đối chặt. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) mật số tếbào là 108/ml tương ứng với giá trị OD là 0.145-0.45, nhưng theo chúng tôi để đạtđược 108 tế bào/ml thì giá trị OD phải là 1.5-1.8. với so sánh này chúng tôi nghi ngờđã có một lượng lớn tế bào bị chết khi pha loãng bằng nước cất. Chúng tôi tiến hànhlặp lại thí nghiệm, sử dụng nước muối sinh lý để pha loãng.Biểu đồ 4.2 Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nước muối sinh lý. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. 41 Dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật số tế bào ta thấy đểđạt được mật số tế bào từ 5 x 107 – 108 tế bào/ ml thì ta nên chọn dịch nuôi cấy có giátrị OD từ 0.6 – 1, kết quả này khác biệt rất nhiều so với lần thí nghiệm thứ 1. Điều đócho thấy khi pha loãng bằng nước muối sinh lí cho kết quả chính xác hơn khi phaloãng bằng nước cất. So sánh giữa pha loãng bằng nước muối sinh lý và pha loãngbằng nước cất vô trùng có sự khác biệt rất lớn. Pha loãng bằng nước cất vô trùng số tếbào đếm được sẽ ít hơn khi pha loãng bằng nước muối sinh lý dù chúng có giá tri ODtương đương nhau. Kết quả này cho thấy khi dùng nước cất vô trùng pha loãng sẽ cómột số tế bào bị chết. Vì vậy, khi cần sự chính xác thì phải sử dung nước muối sinh lýđể pha loãng. Và khi so sánh kết quả này với nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự(2004) vẫn có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này do nhiều nguyên nhân. Trong đó cóhai nguyên nhân chính là chủng vi khuẩn và thiết bị đo OD. Những điều cần lưu ý Do phải hút dịch vi khuẩn đang nuôi cấy để đo OD nhiều lần nên dịch nuôi cấy rấtdễ bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài, phải cẩn thận khi thao tác. Mật độ tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố sau Thể tích môi trường nuôi cấy Lượng tế bào vi khuẩn cho vào ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy Tốc độ của máy lắc Vì vậy mặc dù mỗi lần xác định giá trị OD đều có các mốc thời điểm cụ thể, nhưngkhông thể áp dụng các mốc thời điểm này để chuẩn bị khả nạp mà không cần xác địnhgiá trị OD. 424.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml a b c DC Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây.(a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 30 :3 phục hồi trong800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp vàplasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịchphục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(c) biếnnạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môitrường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lênđĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. . 43 a b c DC Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây.(a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μlmôi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môitrường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bàokhả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở37oC.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp)phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LBagar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả bi ...