Nghiên cứu tính đa dạng của allele HLA-DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP) ở dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam

Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA không những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác. Mời các bạn cùng tham khảo nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu tính đa dạng của allele HLA-DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP) ở dân tộc Kinh miền Trung Việt NamTẠPCHÍKHOAHỌC,ĐạihọcHuế,Số18,2003 NGHIÊNCỨUTÍNHĐADẠNGCỦAALLELEHLADQA1 BẰNGKỸTHUẬTPOLYMERASECHAINREACTIONSEQUENCE SPECIFICPRIMERS(PCRSSP)ỞDÂNTỘCKINH MIỀNTRUNGVIỆTNAM TrầnĐìnhBình TrườngĐạihọcYkhoa,ĐạihọcHuế WangLinlin,LinWeixiong TrườngĐạihọcYkhoaQuảngTây,TrungQuốc Hệkhángnguyênbạchcầungười(HLA,humanlymphocyteantigen)nằmtrên nhiễmsắcthểthứ6,đâylàmộthệkhángnguyênrấtphứctạpvàđadạng.HệHLAkhôngnhữnglàtiêuchíditruyềncủamỗingười,màđồngthờicònliênhệchặtchẽtớichứcnăngđiềuhòamiễndịchvàcácbệnhtậtkhác[13].NhữngngườikhôngcùngmộtloạihìnhphânbốcácallelecủaHLAthìtínhnhạycảmhaysứcđề kháng vớimộtsốbệnhkhônggiốngnhau[13].Nhiềutácgiảnướcngoàiđãnghiêncứusựkhácbiệtvề phânbố alleleHLADQA1trongquầnthể ngườiđãpháthiệnmộtsốngườimangnhữngallelenàysẽ cókhả năngnhạycảmhayđề khángvớimộtsốbệnhtậtnhấtđịnh.Trongthựctế,mỗidântộccómỗibốicảnhditruyền,yếutốditruyềnkhácnhau,cùngmộtdântộcnhưngkhácnhauvềvịtríđịalý...thìsụphânbốcácallelescủahệHLAcũngkhácnhau[411].ỞTrungQuốcđãcónhiềunghiêncứuvề hệ HLA,nhấtlàsự phânbố củaalleleHLADQA1trênnhiềudântộcnhư Hán,Choang,BốY,DuyNgôNhĩ,Mãn...,TháiLancũngđãcóbáocáovềvấnđềnày[11], nhưngchođếnnaychưacóbáocáonàovề phânbố alleleHLADQA1 ởViệtNam. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen Polymerase Chain ReactionSequenceSpecificPrimers(PCRSSP)[12]đểnghiêncứutínhđadạngcủasựphânbố 81alleleHLADQA1ởdântộcKinh,miềnTrungViệtNamđểgópphầnnghiêncứusựkhácbiệtvềditruyềngiữacácdântộckhácnhau. I.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 1.Đốitượngnghiêncứu:là214thanhthiếuniênkhỏemạnh,tuổitừ 736,dântộcKinh,cưtrútạicáctỉnhThừaThiênHuế,QuảngTrịvàQuảngBình,tỉlệnamnữ1:1.Tuổibìnhquânlà14tuổi. 2.TáchDNA:Trênmỗiđốitượnglấy2mlmáutĩnhmạch,thêm0,5mlNatricitrate3,8%chốngđôngvàdùngphươngphápchiếttáchDNAkinhđiểncócảitiến làPhenol/Chloroform.Cácbướcnhưsau[13]: Với2mlmáuchốngđông,thêm5mldungdịchGelatine3%,trộnđều, ủ ở37 C/10phút,táchlấyphầndịchphíatrên,lytâm3500rpm/5phút,bỏphầndịchphía otrên,thêm2mldungdịchTES2mM,trộnđều,thêm0,5mldungdịch10%SDS,trộnđều,thêm2mldungdịchPhenolbãohòatrongTES.Trộnđều,lytâm3500rpm?5phút,táchlấyphầndịchởtrên,(cóthểtiếnhànhbướcnàythêmmộtlầnnữa),thêm2ml dung dịch Chloroform/Isoamylic (v/v:24/1), trộn đều, ly tâm 3500rpm/5 phút.Táchlấyphầnnướctrong ở trên,thêm5mldungdịchcồnEthylic95%,nhẹ nhàng quay ốngnghiệmđể cácsợiDNAxoắnlại,dùng ốnghútnhỏ nhẹ nhànghútlấy DNAvàbảoquản ở một ốngkháctrongdungdịchcồn75%.Khisử dụngcóthểdùngdungdịchTEhoặcnướccấtđểhòatanDNA. 3.KỹthuậtPCRđểphântíchalleleHLADQA1. 3.1.SpecificPrimers:Căncứ vàobảngcácnucleotidescủacácallelescủahệHLAIInăm2002[14]vàdựavàocácPrimersđặchiệucủaO.Olerup[12],chúngtôilấycácPrimersđặchiệutừTrungtâmnghiêncứuVisinhvậthọcvàCôngnghệSinhhọccủaViệnKhoahọcTrungQuốc(thamkhảobảng1),baogồm9chuỗi5’và7 chuỗi3’hợpthành12đôiPrimersđặchiệuđể khuếchđạivàphântíchexonthứ 2củaHLADQA1allele. 3.2.Primersđốichiếu:MỗilầntiếnhànhPCRđềudùngmộtđôiPrimersđốichiếulàCtrl1(5’TATCATGCCTCTTTGCACCATTC 3’,23mer,Tm660C)? Ctrl2(5’AATGCACTGAACTCCCACATTCC 3’,23mer,Tm700C)đểkiểmsoátvàđốichiếuphảnứngkhuếchđạiPCR. 3.3.KỹthuậtPCRSSP:DựavàophươngphápcủaO.Olerupđể tiếnhành,cụthể là:Mỗi ốngtiếnhànhPCRchứa10µlgồmcó : 75ngtiêubảnDNA , dungdịchđệm5xPCR(50mmolKCl;1.5mmolMgCl2;10mmolTrisHCl(pH8.3);0.001%(w/v) Gelatin)1%BSA;200àldNTPschínhlàcácdATP, dGTP, dCTPvàdTTP; 0.25àMcácđôiPrimersđặchiệu, 0.05àMđôiPrimersđốichiếuvà0.50IUTaqDNApolymerase.Tiếnhành30tuầnhoàn,mỗituầnhoànnhư sau:Biếntính94 oC/30giâyGiảm nhiệt62oC/30giâyN ốidài72oC/90giây.Sảnphẩmthu ...