Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số hoạt tính sinh học của Fucoidan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii

Bài viết tiến hành các nghiên cứu phương pháp kết tủa fucoidan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii), sau đó tinh sạch fucoidan bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH và ABTS, hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) và kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) từ các phân đoạn thu được.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số hoạt tính sinh học của Fucoidan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Lê Thị Mỹ Ngọc1, Nguyễn Thị Minh Chi1, Nguyễn Phạm Cẩm Tiên1, Hoàng Thị Ngọc Nhơn1 1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường ĐH Công nghiệp thực phẩm Tp. HCM * Email: myngocdhtp198@gmail.com Ngày nhận: 7/7/2018; Ngày chấp nhận: .../ 2018 ABSTRACT Trong nghiên cứu này, tiến hành các nghiên cứu phương pháp kết tủa fucoidan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii), sau đó tinh sạch fucoidan bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH và ABTS, hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) và kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) từ các phân đoạn thu được. Các phân đoạn được chọn khi qua sắc ký trao đổi ion có độ tinh sạch cao từ 49.02% - 61.14%. Tổng hàm lượng fucoidan sau tinh sạch với hiệu suất thu hồi đạt 60.99%. Ngoài ra, phân đoạn fucoidan sau sắc kí trao đổi ion còn có hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) với MIC là 380 μg/ml và kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) với MIC lần lượt là 680 μg/ml và 580 μg/ml, khả năng bắt gốc tự do DPPH với IC50 đạt 303.51 (μg/ml), ABTS với IC50 đạt 299.97 μg/ml. Từ khóa: fucoidan, rong sụn, tinh sạch, hoạt tính sinh học 1. GIỚI THIỆU Rong sụn thuộc ngành tảo đỏ đây là loài rong biển có giá trị kinh tế cao. Trong rong sụn hàm lượng nước chiếm 77 - 91% còn lại là phần trăm chất khô. Trong chất khô chứa chủ yếu là glucid, protein, chất khoáng, lipip, sắc tố, enzim và cacbohydrat… Hàm lượng cacbohydrate dao động từ 50- 60% và thường tập trung chủ yếu ở thành tế bào gồm có cellulose và các loại đường có hoạt tính sinh học [1]. Nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về cách khai thác các hợp chất quý này. Fucoidan là một sulfate polysacharide dị thể với thành phần cấu tạo hết sức phức tạp. Fucoidan đầu tiên được phân lập xác định là một polysacharide có chứa L-fucose và D-xylose. Fucoidan là một hợp chất đa dạng về công thức cấu tạo nên có nhiều hoạt tính sinh học đáng được quan tâm như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch,...[2]. Do đó, fucoidan đã trở thành đề 234 Lê Thị Mỹ Ngọc, Nguyễn Thị Minh Chi, Nguyễn Phạm Cẩm Tiên, Hoàng Thị Ngọc Nhơn tài thu hút được các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Rong sụn tươi (Kappaphycus alvarezii) được thu nhận ở Khánh Hòa. Rong được rửa sạch nhiều lần bằng nước và loại bỏ các tạp chất bằng rây, sấy đối lưu ở 600C, nghiền thành bột bằng máy xay khô. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Dịch trích: Cân 120g rong cho vào cốc và ngâm với ethanol 80% trong 12 giờ. Trích ly bã với dung môi HCl (1.38M) 1:40 (w/v), nhiệt độ 880C trong 3.5 giờ. Kết tủa dịch trích 1 giờ với TCA ở nhiệt độ lạnh, sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút loại tủa protein để thu dịch trích ly fucoidan [3]. 2.2.2. Khảo sát phương pháp kết tủa trước tinh sạch fucoidan Phương pháp 1 (tủa 1 giai đoạn): Tiến hành kết tủa fucoidan từ dịch trích với ethanol 99%. Thêm cồn 99% vào bình chứa dịch trích với tỉ lệ 70: 29 (w/w) để nồng độ cồn trong dung dịch đạt 70% trong 12 giờ (4oC) để kết tủa fucoidan, sau đó ly tâm thu tủa fucoidan [4]. Phương pháp 2 (tủa 2 giai đoạn): Kết tủa fucoidan với ethanol 99%. Thêm cồn 99% vào bình chứa dịch trích với tỉ lệ 30:69 (w/w) để nồng độ cồn trong dung dịch là 30%, giữ ở nhiệt độ lạnh trong 4 giờ rồi ly tâm loại tủa thu dịch. Tiếp tục thêm cồn 99% vào dịch (29:40 w/w) để nồng độ cồn là 70%, giữ ở 40C trong 12 giờ để kết tủa fucoidan, ly tâm 5000 vòng/phút 15 phút, thu tủa fucoidan [4]. 2.2.3. Khảo sát quá trình tinh sạch fucoidan bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion Thực hiện nhồi cội sắc ký trao đổi ion với 3g DEAE – Cellulose. Cân 1g tủa hòa với 5ml đệm, ly tâm lấy dịch cho vào cột, cho từ từ đệm vào cột trao đổi ion (∅1cm, dài 12cm) điều chỉnh tốc độ dòng 5ml/10phút. Rửa giải lần lượt bằng dung dịch đệm bổ sung NaCl. Ở mỗi nồng độ NaCl tiến hành rửa giải 30ml, tăng nồng độ muối NaCl cao hơn để tiếp tục quá trình rửa giải cho đến nồng độ cuối. Các loại đệm được khảo sát (tris-HCl, phosphate, acetate), nồng độ muối rửa giải được khảo sát (0.5M, 1M, 1.5M, 2M). Fucoidan được thu theo từng phân đoạn, mỗi phân đoạn 10ml. Hút 0.1ml dịch ở mỗi phân đoạn + 0.9ml nước cất hai lần cho vào ống nghiệm và tiến hành xác định hàm lượng fucoidan. 2.2.4. Thử hoạt tính chống oxy hóa Phương pháp DPPH Trên nguyên tắc DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho 235 Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong sụn kappaphycus alvarezii chất thử nghiệm vào hỗn hợp, chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Cho 10 mg thuốc thử DPPH vào cốc có dán giấy bạc bên ngoài, đậy kín. Bổ sung thêm lượng methanol tinh khiết. Lấy 0.15 mL mẫu cho vào ống nghiệm đã bịt kín bằng giấy bạc. Bổ sung 2.85 mL dung dịch thuốc thử DPPH đã chuẩn bị ở trên. Lắc đều và ủ trong tối 30 phút. Đo mật độ quang tại bước sóng 517 nm [5]. Phương pháp ABTS ABTS là một gốc tự do bền phát quang màu xanh ở 734 nm. Kh ...