Nghiên cứu trình tự một số gen độc lực của yersinia pestis và phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định Yersinia pestis gây bệnh ở Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trênhai plasmid độc lực là pPCP1 và pMT1) của chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, chính xác Y. pestis gây bệnh. Nghiên cứu đã góp phần làm phong phú thêm những kết quả về đa dạng di truyền các gen độc lực của VK dịch hạch cũng như cung cấp công cụ phân tử hữu hiệu cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác Y. pestis có độc lực.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu trình tự một số gen độc lực của yersinia pestis và phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định Yersinia pestis gây bệnh ở Việt NamTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦAYERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCRXÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAMĐinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**; Nguyễn Văn An**Cao Thị Dinh***; Triệu Thị Nguyệt***TÓM TẮTMục tiêu: xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trênhai plasmid độc lực là pPCP1 và pMT1) của chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lậpở Việt Nam và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, chính xác Y. pestis gây bệnh.Vật liệu và phương pháp: chủng Y. pestis Yp1 có đầy đủ độc lực được lưu giữ tại “Ngân hàngChủng và Gen” của Học viện Quân y. Toàn bộ chiều dài gen ypo2088, pla và caf1 sau khikhuếch đại chính xác được tách dòng và phân tích trình tự. Từ kết quả phân tích trình tự kếthợp với trình tự các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen, 3 cặp mồi là ypo2088F/R, plaF/Rvà caf1F/R đã thiết kế để khuếch đại đồng thời gen đích tương ứng trong phản ứng PCR đamồi xác định VK dịch hạch gây bệnh. Kết quả và kết luận: tách dòng và phân tích trình tự đầyđủ 3 gen là ypo2088, pla và caf1 của chủng VK Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam. Xác địnhđược 1 đột biến sai nghĩa trên gen pla, hai gen còn lại có mức độ tương đồng 100% khi sosánh với trình tự tham chiếu (mã số CP000900). Kết quả một lần nữa chứng minh, trình tự genypo2088, pla và caf1 rất ổn định, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Y. pestis.Trình tự đầy đủ 3 gen này đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số lần lượt làKM880027, KM880025 và KM880026. Đã thiết kế thành công phản ứng PCR đa mồi khuếchđại đồng thời 3 gen đích xác định chính xác VK dịch hạch gây bệnh.*Từ khóa: Caf1 (F1 capsule antigene); Độc lực; PCR đa mồi; Yersinia pestis.Study on the Complete Sequences of Virulence Genes of YersiniaPestis and Development of a Multiplex PCR Assay for Detection ofPathogenic Yersinia Pestis in VietnamSummaryObjectives: Sequence analysis of the entire ypo2088 gene (within bacterial chromosome),pla and caf1 genes (on the virulence plasmids pPCP1 and pMT1) of the pathogenic Yersiniapestis strain Yp1 isolated in Vietnam and development of a multiplex PCR assay for rapid andaccurate detection of pathogenic Y. pestis. Materials and methods: Y. pestis strain Yp1 with fullvirulence was provided by Strain and Gene Bank of Vietnam Military Medical University. Total DNAwas extracted from culture media following autoclaved inactivation. Subsequently, full-length ypo2088,* Học viện Quân y** Bệnh viện Quân y 103*** Đại học Khoa học tự nhiênNgười phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)Ngày nhận bài: 02/03/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015Ngày bài báo được đăng: 31/03/201557TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015pla and caf1 genes were amplified using high-fidelity PCR. The purified PCR products werecloned in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and they were sequenced fromboth ends. According to these sequencing results and the reference sequences in Genbank,three primer pairs, including ypo2088F/R, plaF/R and caf1F/R, were designed in a multiplex PCRassay for detection of pathogenic Y. pestis. Results and conclusions: One missense mutationwas identified in pla gene, two remaining genes were found to be 100% similar in sequence tothe reference sequences of Y. pestis Angola (accession number KP000900). These results againdemonstrate that ypo2088, pla, caf1 gene sequences are very conservative, with no significantdifference among Y. pestis strains. The complete sequences of these genes were submitted toGenbank with accession number KM880027, KM880025 and KM880026, respectively. A multiplexPCR assay that amplifies these three target genes was successfully developed for rapid andaccurate detection of pathogenic Y. pestis.*Key words: Caf1 (capsule fraction 1 gene); Multiplex PCR; pla (plasminogen gene);Yersinia pestis.ĐẶT VẤN ĐỀY. pestis là VK Gram âm, không sinh bàotử thuộc chi Yersinia - họ Enterobacteriaceae.Trong 11 loài thuộc chi Yersinia, chỉ cóba loài gây bệnh ở người là Y. pestis,Y. pseudotuberculosis và Y. enterocolitica.Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnhdịch hạch và viêm phổi cấp tính phân biệtvới hai loài còn lại [8, 10]. Tiềm năng hủydiệt của dịch hạch đã được chứng minhqua thùc tÕ lµ 200 triệu ca tử vong tronglịch sử, dẫn đầu danh sách các bệnhtruyền nhiễm nguy hiểm. Theo Tổ chức Ytế Thế giới, từ 1989 đến 2003, thế giới đãghi nhận 38.310 ca nhiễm và 2.845 ca tửvong, tập trung chủ yếu ở châu Phi vàchâu Á - nơi thiếu hoặc chưa đáp ứngđầy đủ của hệ thống giám sát, các cơ sởchẩn đoán hay báo cáo dịch [5]. Đặc biệt,những năm gần đây, mối quan tâm đốivới VK dịch hạch được đặt ở mức cao, dokhả năng sử dụng Y. pestis như mộ ...