PCR & realtime PCR

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR: PCR (Polymerase Chain Reaction) là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Nguyên tắc của PCR: Giai đoạn biến tính: nhiệt độ được đưa lên 94 độ C, các liên kết hydro của mạch đôi DNA bị mất đi, nhờ đó DNA đích bị biến tính thành 2 mạch đơn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
PCR & realtime PCRPCR & REALTIME PCRÖÙNG DUÏNG TRONG CHAÅN ÑOAÙN TAÙC NHAÂN NHIEÃM TRUØNG Phaïm Thaùi BìnhNGUYEÂN TAÉC CUÛA KYÕ THUAÄT PCR 1 Khaùi nieäm veà PCRPCR (Polymerase Chain Reaction)laø thöû nghieäm nhaân baûn moät ñoaïnDNA trong oáng nghieäm döïa vaøocaùc chu kyø nhieät. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Lòch söû phaùt minh PCR Taùm naêm sau (1993), Kary Mullis nhaän ñöôïc ½ giaûi Nobel hoùa hoïc. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 2Nguyeân taéc cuûa PCRGiai ñoaïn bieán tính: nhieät ñoä ñöôïc ñöa leân 94oC,caùc lieân keát hydro cuûa maïch ñoâi DNA bò maát ñi, nhôøñoù DNA ñích bò bieán tính thaønh 2 maïch ñôn.Giai ñoaïn baét caëp: nhieät ñoä ñöôïc haï xuoáng55-65oC, caùc ñoaïn moài (primer) tìm ñeán vaø baétcaëp boå sung vaøo hai ñaàu cuûa ñoaïn DNA ñích.Giai ñoaïn keùo daøi : nhieät ñoä ñöôïc ñöa leân72oC, Tag polymerase keùo caùc dNTP laïi ñaàu 3’cuûa ñoaïn moài ñang baét caëp treân ñaàu 5’ cuûa sôïiDNA ñích vaø toång hôïp maïch boå sung. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc.Nguyeân taéc cuûa PCR Qua moät chu kyø nhieät, moät DNA ñích ñöôïc nhaân thaønh 2 baûn sao. Neáu chu kyø nhieät laëp laïi lieân tuïc n laàn thì töø moät DNA ñích nhaân baûn ñöôïc 2n baûn sao. 3YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG ÑEÁN KYÕ THUAÄT PCR DNA ñích Ñoaïn gen ñaëc hieäu cho HBV daøi khoaûng 190bp DNA ñích laø ñoaïn DNA coù trình töï ñaëc hieäu vôùi taùc nhaân nhieãm truøng. Trình töï DNA ñaëc hieäu chæ coù treân boä gen cuûa moät taùc nhaân nhieãm truøng maø khoâng coù treân caùc taùc nhaân nhieãm truøng khaùc hoaëc töø cô theå vaät chuû. DNA ñích coù vai troø laøm khuoân ñeå toång hôïp sôïi DNA boå sung. Boä gen cuûa M. tuberculosis goàm khoaûng 4000 gen. Löôïng DNA ñích cho moät theå tích Trong ñoù coù gen IS6110 phaûn öùng: naèm raõi raùc nhieàu nôi trong – Plasmide: 1pg ® 10ng boä gen vaø ñaëc hieäu cho M. tuberculosis. Ñoaïn gen – Genome: 50 ® 500ng chuyeân bieät cho IS6110 coù ñoä daøi khoaûng 249bp. 4 PCR mix Thaønh phaàn cuûa PCR mix: – Moài – Taq polymerase – dNTP – MgCl2 – PCR buffer Moài (primer)ð Moài laø moät ñoaïn oligonucleotide daøi khoaûng 20-30 bases vaø coù trình töï boå sung vôùi hai ñaàu cuûa trình töï DNA ñích.ð Moài phaûi ñaëc hieäu, ñaëc tröng cho trình töï DNA ñích, moät moài chæ baùm vaøo moät vò trí nhaát ñònh treân gen.ð Ñeå moài coù theå baét caëp moät caùch hoaøn toaøn ñaëc hieäu treân sôïi khuoân cuûa trình töï DNA ñích: – Nhieät ñoä baét caëp (Ta) phaûi toái öu vaø thöôøng Ta thaáp hôn nhieät ñoä chaûy (Tm) cuûa moài khoaûng 5-10oC. – Tm cuûa moài xuoâi vaø moài ngöôïc khoâng khaùc bieät quaù lôùn. – Tm cuûa moài phuï thuoäc vaøo chieàu daøi cuûa moài vaø tyû leä G vaø C trong thaønh phaàn cuûa moài: Tm (oC) = 2 (A+T) + 4 (C+G) – Traùnh trình töï boå sung giöõa moâi xuoâi vaø moài ngöôïc. – Nucleotide (3 nucleotide hoaëc nhieàu hôn) ôû ...