Phân lập và thiết kế vector phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận

Trong nghiên cứu tác giả đã phân lập từ.soybean (Glycine max) 3 gen có khả năng liên quan đến khả năng chịu hạn bao gồm: GmMYB, GmGLP và GmCHS7. Những gen này được đặt dưới sự kiểm soát của Promer 35S trong vectơ nhị phân pZY101-Asc.carrying ammonium glufosinate là gen đánh dấu chọn lọc. Agrobacteium tumefaciens strains được biến đổi với các vectơ này đã được sử dụng để tạo ra các dòng đậu tương biến đổi gen dẫn đến một số kết quả ban đầu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập và thiết kế vector phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN Nguyễn Anh Vũ, Lương Thanh Quang, Nguyễn Hữu Kiên, Bùi Thúy Hiền, Dương Tuấn Bảo, Nguyễn Minh Ngọc, Nguyễn Trung Anh, Đỗ Như Quỳnh, Trần Quốc Bảo, Vũ Hoàng Nam, Trần Thu Cúc, Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Nguyễn Văn Đồng Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Gene isolation and construction of expression vector as material for creating stress-tolerant transgenic crop plants Among abiotic stress factors, drought causes most damage to crop yield world wide. In the wake of increasing frequency and scale of drought due to global warming, creating drought tolerant crop plants is not only in the interest of Vietnam but also the world. In our research, we isolated from soybean (Glycine max) 3 genes potentially involved in drought tolerance including: GmMYB, GmGLP and GmCHS7. These genes were placed under 35S promoter’s control in the binary vector pZY101-Asc carrying ammonium glufosinate resistant bar gene as the selection marker. Agrobacteium tumefaciens strains transformed with these vectors were used to create transgenic soybean lines resulting in some promising initial results. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, drought tolerant, glufosinate, GmGLP1, GmMyb, GmCHS7, soybean, transgenic I. ĐẶT VẤN ĐỀ * Hạn hán - tình trạng lượng nước tự nhiên thấp hơn mức trung bình trong một thời gian dài trên diện rộng và mang tính khu vực, là một trong các yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới [1]. Một số mô hình dự đoán biến đổi khí hậu cho thấy hạn hán sẽ xảy ra thường xuyên hơn trong tương lai do những tác động dài hạn của hiện tượng ấm lên toàn cầu [2, 3]. Kết quả là diện tích đất canh tác ngày càng bị thu hẹp. Trước những thách thức nêu trên, việc nghiên cứu phát triển những giống cây trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu các điều kiện bất thuận đang là một trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học. Tình trạng thiếu nước dẫn đến một loạt các thay đổi về hình thái, sinh lý, hóa sinh cũng như ở cấp phân tử gây ảnh hưởng xấu tới sự phát triển và năng suất cây trồng [4]. Tương tự như stress mặn, stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội Người phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý. 258 môi và phân bố ion trong tế bào [5, 6]. Cây trồng phản ứng với các stress hạn và mặn thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất chống oxi hóa và tích lũy các chất tan tương thích [7, 8, 9]. Cơ chế phản ứng của tế bào thực vật với điều kiện hạn được thể hiện trong hình 1. Các gen phản ứng với stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính. Nhóm 1 mã hóa cho các protein chức năng tham gia các phản ứng cuối trong chuỗi đáp ứng stress bao gồm gen điều hòa áp suất thẩm thấu [10], các protein chống oxi hóa [11], aquaporin [12], protein phổ biến trong thời kì hình thành phôi muộn (LEA) [13], các protein vận chuyển [14]. Nhóm 2 mã hóa các protein điều khiển bao gồm các yếu tố phiên mã và các protein kinase truyền tin. Một số yếu tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu mặn và chịu hạn thường gặp bao gồm WRKY [15,16], bZIP [15], MYB [17,18], DREB [19], NCED [20] và AP2/ERF [21]. Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [22], MAPK [23], RPK [24], PIK [25] và protein kinase serine/threonine [26]. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất Hình 1. Cơ chế phản ứng của thực vật với điều kiện hạn Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phân lập và thiết kế vector tăng cường biểu hiện 3 gen: GmMYB, GmCHS7 và GmGLP1.GmMYB (XM_003549497) ban đầu được xếp vào nhóm MYB, tuy nhiên với trình tự mang vùng WRKY, gen này được xếp lại vào nhóm các yếu tố phiên mã WRKY mã hóa cho protein WRKY24. Nghiên cứu gần đây cho thấy WRKY nằm trong số các yếu tố phiên mã tăng cường biểu hiện trong điều kiện mặn và có nhiều khả năng giúp nâng cao khả năng chịu mặn của đậu tương [27]. GmGLP1 (EU916269) là một trong các gen mã hóa protein giống germin (germin-like protein) tìm thấy trong hạt nảy mầm. Tất cả các protein 259 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM germin đều mang motif germin tạo thành cấu trúc lõi thùng beta tham gia vào gắn kết với kim loại [28]. Mặc dù còn nhiều germin chưa được xác định chức năng, các phân tích chức năng tương đồng cho thấy germin tham gia vào nhiều quá trình quan trọng khác nhau như phát triển, điều hòa áp suất thẩm thấu, dao động quang chu kỳ và phòng vệ [29]. Một báo cáo gần đây cho thấy tăng cường biểu hiện germin tách từ đậu tương giúp tăng khả năng chịu mặn của cây thuốc lá chuyển gen [30]. Cuối cùng, GmCHS7(XM_003517481) là một trong các gen thuộc nhóm đa gen mã hóa chalcone synthase tham gia sinh tổng hợp flavonoid/isoflavonoid. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy chalcone synthase tham gia vào phản ứng phòng vệ của thực vật chống lại các tác nhân sinh học gây bệnh [31]. Một số nghiên cứu lại cho thấy GmCHS7 biểu hiện mạnh ở rễ và có nhiều khả năng tham gia vào quá trình hình thành nốt sần rễ cây họ Đậu [32]. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Vật liệu thực vật: Giống đậu tương DT2008, DT84,Williams 82 và ĐT22. Các hóa chất, vật tư tiêu hao cơ bản phục vụ tách chiết và clone gen. Các plasmid pGEMT-easy, pRTL2 và pZY101-Asc. gen GmMYB, GmGLP1 và Ba dòng đậu tương DT2008, DT84 và Williams 82 đã được cho nảy mầm trong xô nhựa chứa đất giá thể. Mỗi dòng gieo 100 hạt kích thước lớn, vỏ trơn đều, không rạn nứt hay bị tổn thương, không có dấu hiệu bị mọt. Các thí nghiệm được tưới nước đầy đủ hàng ngày, mỗi xô 100 ml nước. Sau ba tuần, ngừng tưới nước trong 3 ngày. Sau đó xử lý hạn nhân tạo bằng cách tưới 200 ml dung dịch sorbitol 7% (w/v). 15 mẫu lá đã thu được từ 3 giống tại 5 thời điểm: Ngay trước khi xử lý hạn, sau xử lý hạn 1h, 5h, 12 ...