Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus Spp. sinh tổng hợp enzyme invertase

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus Spp. sinh tổng hợp enzyme invertase" nhằm mục đích phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus spp. có khả năng sinh enzyme invertase và khảo sát một số đặc tính của enzyme này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus Spp. sinh tổng hợp enzyme invertase PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS SPP. SINH TỔNG HỢP ENZYME INVERTASE Phạm Thùy Trang1, Nguyễn Thị Thu1, Nguyễn Đức Thái1, Thái Thị Hà Phương1, Đặng Quang Cảnh1 ABSTRACT Invertase (β-fructofuranosidase E.C.3.2.1.26) catalyzes the hydrolysis of sucrose to glucose and fructose so it is mainly used in the food industry. This study was conducted to isolate and screen fungal strains Aspergillus spp. which have invertase activity and study some biochemical characterization of invertase enzyme. From different samples, we isolated 16 fungal strains which have the ability synthesis invertase enzyme with O1, L1.2 expressing highest activity. Strains O1 and L1.2 produced high levels of invertase enzyme under optimized culture conditions at an optimum temperature 35oC, pH 6,5 with ure as nitrogen source and sucrose as carbon source. Enzyme invertase of strain O1 exhibited optimum at temperature 50oC, pH 5,5; strain L1.2 exhibited optimum at temperature 40 oC, pH 6. This research showed that the activity of this enzyme increases as additional Mn2+. Key word: Invertase enzyme, Aspergillus spp., , enzyme activity, TÓM TẮT Invertase (β-fructofuranosidase E.C.3.2.1.26) là enzyme có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose và fructose nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Nghiên cứu này nhằm mục đích tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus spp. có khả năng sinh enzyme invertase và khảo sát một số đặc tính của enzyme này. Từ các nguồn mẫu khác nhau chúng tôi đã phân lập được 16 chủng có khả năng tổng hợp enzyme invertase trong đó chủng O1, L1.2 biểu hiện hoạt tính invertase cao nhất. Hai chủng O1 và L1.2 có khả năng sinh tổng hợp enzyme tốt nhất ở 35oC và pH 6,5 với nguồn nitrogen là urea đối với chủng L1.2 và NaNO3 đối với chủng O1, nguồn carbon là sucrose đối với chủng L1.2 còn với O1 là fructose. Enzyme invertase của chủng O1 hoạt động tối ưu ở 50oC, pH 5,5; đối với chủng L1.2 enzyme này hoạt động tốt nhất ở 40oC, pH 6. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính của enzyme này tăng lên khi bổ sung Mn2+. Từ khóa: Enzyme invertase, Aspergillus spp., hoạt tính enzyme, 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Invertase (EC3.2.1.26) là một enzyme thuộc họ GH 32 của glycoside hydrolase (Alberto et al. 2004), nó còn được biết đến với các tên gọi khác như: β-fructofuranosidase, saccharase, glucosucrase, sucrase, β –fructosidase. Invertase có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose và fructose (tỉ lệ 1:1) gọi là đường nghịch đảo. Invertase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là ngành sản xuất bánh kẹo và nước giải khát do đường nghịch đảo ngọt hơn và ít kết tinh hơn so với đường sucrose. Ngoài ra, invertase còn được ứng dụng trong sản xuất đường fructooligosaccharide (FOS) – là loại đường có chức năng làm giảm cholesterol, phospholipid và triglycerides trong máu, cũng như làm giảm huyết áp tâm trương (Nguyen et al, 2005). Invertase là một enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, vi khuẩn, nấm men Saccharomyces và một số vi nấm như Aspergillus niger (Rubio và Navarro, 2006). Tuy nhiên nghiên cứu trong nước về các chủng Aspergillus sinh tổng hợp invertase còn hạnchế nên chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm 1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam 505 mục đích phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus spp. có khả năng sinh enzyme invertase và khảo sát một số đặc tính của enzyme này. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu thí nghiệm Vật liệu phân lập nấm mốc: các chủng nấm mốc được phân lập từ các nguồn vật liệu khác nhau: mẫu lá mục, lạc, gạo, tổ ong mốc, vỏ chanh được lấy từ các khu vực và địa điểm khác nhau: Hà Nội, Nam Định. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các chủng nấm mốc Aspergillus được phân lập theo phương pháp Ulster (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000) trên loại môi trường phân lập là PDA và Czapek-Dox. Sau đó làm thuần bằng cách cấy truyền trên môi trường PDA. Các chủng nấm mốc Aspergillus được nuôi lắc trong môi trường Czapek-Dox lỏng pH 5.5 (Sigma- Mỹ), tốc độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 35oC, mật độ tiếp giống 106 bào tử cho 100ml môi trường lên men. Sau 3 ngày nuôi cấy thu dịch nuôi đem li tâm 10000 rpm ở 4oC trong 20 phút. Phần dịch lỏng thu được sau li tâm sẽ được đưa đi thử hoạt tính enzyme invertase. Dựa vào nguyên lý enzyme invertase có khả năng thủy phân liên kết β-1,2 glucoside của sucrose sản phẩm là glucose và fructose tỉ lệ 1:1. Hoạt tính tương đối của enzyme invertase được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch: phương pháp này sử dụng thuốc thử TTC 0.1% (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride trong NaOH 0,5M). Đường khử (glucose) sinh ra từ quá trình thủy phân sucrose của enzyme invertase sẽ khử TTC thành triphenyformazon có màu hồng, lượng triphenyformazon tỉ lệ thuận với lượng đường khử sinh ra. Giếng thạch được đục trong môi trường cơ chất sucrose 3% trong đệm natri acetate 50mM pH 5,0. Cho 100µl dịch enzyme thô vào vào giếng để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thuốc thử TTC được thêm vào bằng cách phun lên mặt thạch và ủ trong bóng tối 20 phút, rửa đệm acetate 0,1M pH 5,0. Enzyme invertase khuếch tán vào đĩa thạch sản phẩm thủy phân của nó được khẳng định bằng sự xuất hiện vòng đỏ quanh giếng. Phương pháp so màu DNS: Ủ hỗn hợp phản ứng gồm 200µl enzyme thô, 500µl dung dịch sucrose 5% và 300µl đệm acetate 50mM pH 5,0 ở 500C trong 30 phút (Bernfeld et al.,1955). 1ml DNS (3, 5-dinitrosalicylic acid) được cho thêm vào hỗn hợp trên và kết thúc phản ứng bằng cách ngâm ống nghiệm trong bể nước sôi 5 phút. Sau khi ...