Phân lập và xác định một số gene sinh độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens trên gà

Đề tài nghiên cứu được thực hiện với mục đích xác định tỉ lệ hiện diện C. perfringens và phát hiện một số gene quy định khả năng sinh độc tố của C. perfringens phân lập từ gà thả vườn. Tổng số 238 mẫu ruột gà được lấy từ 23 trại (20 trại gà có biểu hiện lâm sàng trên đường tiêu hóa, 3 trại gà khỏe) tại một số tỉnh phía Nam được sử dụng để xác định sự hiện diện và một số gene quy định khả năng sinh độc tố của C. perfringens bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và kỹ thuật PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập và xác định một số gene sinh độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens trên gà Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GENE SINH ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN GÀ Lê Đào Diễm Kha* Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: ledaodiemkha@gmail.com TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu được thực hiện với mục đích xác định tỉ lệ hiện diện C. perfringens và phát hiện một số gene quy định khả năng sinh độc tố của C. perfringens phân lập từ gà thả vườn. Tổng số 238 mẫu ruột gà được lấy từ 23 trại (20 trại gà có biểu hiện lâm sàng trên đường tiêu hóa, 3 trại gà khỏe) tại một số tỉnh phía Nam được sử dụng để xác định sự hiện diện và một số gene quy định khả năng sinh độc tố của C. perfringens bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và kỹ thuật PCR.Trên mẫu lấy từ gà bệnh, tỉ lệ hiện diện Clostridium spp. và C. perfringens là 51,5 % và 16,8 %. Trên mẫu lấy từ gà khỏe, tỉ lệ hiện diện Clostridium spp. và C. perfringens là 27,8 %. 18,2 % phân lập C. perfringens mang gene cpa, 4,5 % mang gene cpb và gene netB không phát hiện trên tất cả các phân lập. Từ khóa: C.perfringens, gene sinh độc tố, PCR. ISOLATED AND DETERMINE TOXIN GENE OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS FROM CHICKEN Le Dao Diem Kha* Nong Lam University, NLU-HCM *Corresponding authour: ledaodiemkha@gmail.com ABSTRACT The study was conducted to determine the incidence of C. perfringens and to detect some of the genes that regulate the ability to produce toxins of C. perfringens isolated from the chickens. A total of 238 chicken intestinal specimens were collected from 23 farms (20 chicken farms with digestive tract and 3 healthy chicken farms) in some southern provinces used to determine the presence and some genes toxicity of C. perfringens by culture and PCR technique. On the samples taken from diseased chickens, the presence rate of Clostridium spp. and C. perfringens were 51.5% and 16.8%. On samples from healthy chickens, the presence rate of Clostridium spp. and C. perfringens was 27.8%. 18.2% C. perfringens isolates carry the cpa gene, 4.5% carry the cpb gene and the netB gene is not detectable on all isolates. Keywords: C. perfringens, toxin gene, PCR. TỔNG QUAN C. perfringens được phân thành 5 type bao Clostridium perfringens (C. perfringens) là gồm A, B, C, D và E dựa vào khả năng sinh vi khuẩn gram dương, có khả năng sinh bào 4 loại độc tố chính là alpha (α), beta (β), tử (Hình 1), phát triển tốt trong môi trường kị epsilon (ε) và iota (ι). C. perfringens type A khí nhưng có khả năng sống trong điều kiện là nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử hiếu khí. C. perfringens khu trú trong đường trên gà và thường được phân lập từ các ruột của động vật và người nhưng có thể trường hợp lâm sàng trong thú y. C. không gây bệnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi perfringens type C cũng là một tác nhân gây vi khuẩn có thể tăng nhanh số lượng và sinh viêm ruột hoại tử ở gia cầm và người nhưng độc tố. Tùy tác động của mỗi loại độc tố sẽ không phổ biến như type A. C. perfringens gây ra các thể bệnh với biểu hiện lâm sàng và type B, D và E gây bệnh chủ yếu trên các bệnh tích khác nhau trên gà (Park và ctv, loài dê, cừu, bò và heo (Jalbert, 2008; Llanco 2015). và ctv, 2012). 448 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Hình 1. Vi khuẩn C. perfringens VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP định danh vi khuẩn C. perfringens Nội dung 1: Xác định Clostridium spp. và Bảng 1. Số lượng mẫu khảo sát Đối tượng lấy mẫu Số trại (n) Số mẫu gà (n) Gà khỏe 3 36 Gà bệnh 20 202 Tổng cộng 23 238 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu Nội dung 2: Xác định một số gene quy Lấy mẫu tại trại: Gà được lấy theo 2 nhóm: định khả năng sinh độc tố của vi khuẩn C. (1) Gà khỏe (gà không biểu hiện triệu chứng perfringens bệnh), (2) gà bệnh (kém ăn, chậm lớn, gầy Ly trích DNA của vi khuẩn C. perfringens ốm, xù lông và tiêu chảy phân sáp hoặc có Lấy một vòng canh khuẩn từ ống vi khuẩn lẫn máu). Gà được mang về phòng xét (gốc vi khuẩn C. perfringens được bảo quản nghiệm, tiến hành mổ khám để quan sát bệnh ở -70oC) cấy trên môi trường thạch máu tích và lấy chất chứa bên trong ruột làm mẫu (nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, 37oC 24 - phân lập C. perfringens. 28 giờ). Xử lý mẫu ruột để phân lập vi khuẩn: dùng Dùng que cấy vô trùng chọn một khuẩn lạc kéo vô trùng cắt dọc ruột để bộc lộ lòng ruột, đặc trưng (tròn, trắng xám, bề mặt phẳng) để sau đó cạo lấy hết chất chứa có bên trong nuôi cấy trong môi trường BHI (yếm khí, ruột sử dụng làm mẫu nuôi cấy. Lấy 1 gram 37oC/24 giờ). chất chứa pha với 9 ml dung dịch nước muối Quy trình ly trích: theo quy trình của kít ly sinh lý (NaCl 0,9%), đồng nhất hỗn hợp chất trích DNeasy mericon Food Kit Cat. No. chứa bằng vortex, sau đó ủ mẫu ở 70oC/15 69514 (Qiagen). phút. Chọn mồi (primer) Quy trình phân lập Clostridium spp. và định Các đoạn mồi dùng trong phản ứng để xác danh C. perfringens theo TCVN 8400: 28, định các gene độc tố cpa, cpb và netB (Bảng 2014 và phòng thí nghiệm vi sinh ISARA. 2). Bảng 2. Trình ...