Phương pháp điện di DNA

Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR. Axit nucleic nói chung là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phương pháp điện di DNA Phương pháp điện di DNANguyên tắc điện diĐiện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân để phân tích cácđại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người tathường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNAnguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.Axit nucleic nói chung là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịchchuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tácdụng của điện trường. Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện nhữngphân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạyđược những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khiphân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phươngpháp làm hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidiumbromid. Chất này sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dướitia tử ngoại. Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trêngel và có thể phân biệt được phân tử DNA trên cùng một bảng gel. Đối vớigel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạvà vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Trongđiện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn, thường là DNA λ. Khi điện dicho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh với DNA mẫu vớiDNA chuẩn để biết trọng lưọng phân tử, hoặc trích li được DNA khác nhau.Cách tiến hànhHệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệthống soi chụp ảnh. Các bước được tiến hành như sau: - Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE (Tris-acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò viba (làm nóng chảy gel và không tạo bọt). - Làm nguội gel xuống 50÷55°C, thêm 1µl ethidium bromid, đổ gel vào khuôn gel và lắp lược. - Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2÷5 mm. - Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực. - Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế 100÷120V. - Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả. Mô hình máy điện diLưu ý: Tùy thuộc vào kích thước của DNA mẫu mà người ta chọn loại gel(agarose, polyacrlamid), nồng độ gel, loại đệm (TBE hoặc TAE). Đệm TAEcho độ phân giải cao các phân đoạn lớn hơn 4 kb, trong khi đệm TBE cóphân giải cao từ 0,1 đến 3kb. Ngoài ra, độ phân giải các phân đoạn DNA cònphụ thuộc vào phương pháp điện di, tối ưu điện thế, tối ưu lượng DNA nạpvà đệm nạp.Thuốc nhuộm ethidium bromid (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang màcó thể nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. Mặc dù vậy, ái lực liênkết với DNA sợi đơn tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép. DNA nhuộmEtBr được nhận biết bằng tia cực tím. Tại bước sóng 254nm, ánh sáng UVđược hấp thụ bởi DNA và chuyển sang thuốc nhuộm. Tại bước sóng 302nmvà 366nm, ánh sáng UV được hấp thụ bởi chính thuốc nhuộm. Trong cả haitrường hợp, năng lượng được phát xạ ứng với tia tại bước sóng 590nm trongvùng vàng đỏ của quang phổ thấy được. EtBr là chất gây đột biến mạnh, cầnphải mang găng tay khi thao tác với dung dịch thuốc nhuộm này và các gelnhuộm. Để tạo độ phân giải cao rõ nét, các vạch và nền nhạt nên nhuộm gelvới EtBr ngay sau khi điện di.Ưu, nhược điểm và ứng dụng của phương pháp PCRƯu và nhược điểm của phương pháp PCRƯu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại đượcmột trình tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thựchiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiệnđồng thời). Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫuvật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Đểcó đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại.Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễmlớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase khoảng104 (sai sót cho một lần sao chép).Phạm vi sử dụng- Sản xuất mẫu dò đánh dấu phóng xạ (dầu dò) với khối lượng lớn, phù hợpvới phương pháp lai giữa DNA và DNA, RNA và DNA.- Khuếch đại số lượng RNA, do lượng mRNA nhỏ d ...