TÁCH CHIẾT ADN

Tách chiết ADN là cần thiết bởi các thực nghiệm củacông nghệ gen đều tiến hành với ADN (hay ARN)ADN tách chiết được cần đảm bảo về độ tinh khiếtvà độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện được cáckhâu nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật.Có rất nhiều phương pháp tách chiết AND, tuỳ thuộc mụcđích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp tách ADN chophù hợp
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
TÁCH CHIẾT ADNTÁCH CHIẾT ADN GS.TS Nguyễn Quang Thạch Viện Sinh hoc Nông nghiệp1.Nguyên tắc và yêu cầu- Tách chiết ADN là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen đều tiến hành với ADN (hay ARN)- ADN tách chiết được cần đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật.* Có rất nhiều phương pháp tách chiết AND, tuỳ thuộc mụcđích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp tách ADN chophù hợp 2.Các bước chính trong tách chiết ADN1. Phá vỡ vật liệu ban đầu (tế bào, mô) để mở tế bào và giải phóng axit nucleic (ADN và ARN) (nghiền trong ni tơ lỏng và hòa trong đệm chiết)2. Bổ sung các chất chống các chất hoạt hoá enzyme ADNase và làm biến tính các phân tử protein, dịch hữu cơ.v.v.3. Tách ADN khỏi các tạp chất khác (bằng máy ly tâm).4. Kết tủa , rửa và hòa tan ADN (rửa bằng dung dịch cồn, hòa tan trong TE hoặc nước cất) 3. Một số hoá chất thông dụng dùng trong tách chiết axít nucleic - Ni tơ lỏng: Thông thường để phá màng/vỏ tế bào chúng ta phải dùng nitơ lỏng, vì nitơ lỏng có 2 tác dụng chính đó là: + Làm cho màng bị cứng giòn, dễ bị vỡ khi nghiền + Và ni tơ lỏng giữ cho mẫu ở trạng thái lạnh, trạng thái mà các enzym phá huỷ axít nucleic không hoạt động cho tới khi chúng bị ức chế bằng hoá chất. Một số qui trình sử dụng vật liệu đông khô, bởi vật liệu đông khô dễphá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữmẫu ở trạng thái lạnh, vì trong môi trường khô tuyệt đối các ezim pháhuỷ axít nucleic cũng vô tác dụng. - EDTA: Khi màng bị phá vỡ, một loạt các chất đựơc giải phóng radung dịch, trong số chúng có các loại emzim thuỷ phân axít nucleic thànhnhững mảnh vụn, bởi vậy cần phải ức chế sự hoạt động của enzym nàybằng EDTA. Các ion hoá trị hai như: Mg2+ và Ca2+.v.v. rất cần thiết chosự hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic. Nếu trong dung dịch cóEDTA, chất này sẽ liên kết với các ion hoá trị hai nói trên, liên kết nàydẫn tới sự ức chế hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic, do vậymà axít nucleic sẽ không bị phân huỷ. Tris: Axít nucleic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi độ axít và kiềm củadung dịch sử dụng trong tách chiết, axít có thể làm cho axít nucleic bị gãy,chẳng hạn axít clohydric (HCl) làm cho ADN bị đứt ở những vị trí purin,trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao thì ADN sẽ bị tách thành sợi đơn.Để loại trừ ảnh hưởng của axít và kiềm người ta đã sử dụng Tris đểđiều chỉnh pH của dung dịch. CTAB (Cetryl Ammonium Bromide): Là hoá chất dùng trong chiếtsuất axít nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiệnnay. CTAB dung dịch là một dung môi có khả năng hoà tan cao axítnucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong táchchiết axít nucleic. Để tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, mẫu đựơc xửlý với nhiệt khoảng từ 55OC đến 65OC. Ở nhiệt độ như vậy, nó còn cótác dụng làm rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đalượng axít nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệtlà enzym thuỷ phân axít nucleic. Chloroform: Trong dung dịch tách chiết, ADN tạo thành liên kết vớiCTAB, để loại bỏ CTAB và đồng thời làm biến tính protein trong dungdịch cần sử dụng chloroform. Sau đó dung dịch tách chiết được ly tâm,loại bỏ các tạp chất (bị kéo xuống phần phía dưới ống nghiệm) còn lạiaxít nucleic hoà tan trong lớp dung dịch nằm phía trên và được chuyểnsang một ống nghiệm mới. Ethanol hoặc isopropanol: - Ethanol thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion, hay nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy axít nucleic dễ dàng bị kết tủa, sự kết tủa của axít nucleic sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu như được xử lý trong môi trường lạnh. - Isopropanol được dùng để kết tủa axít nucleic trong môi trường không cần có muối, tỷ lệ lượng isopropanol/mẫu theo thể tich là: 1/1. Sử dụng isopropanol có ưu việt là các axít nucleic có trọng lượng phân tử thấp như: những mảnh gãy ADN hoặc ARN.v.v. sẽ không bị kết tủa và chúng dễ dàng bị loại bỏ cùng dung dịch. Enzym RNnase và enzym Dnase: Khi kết tủa sẽ thu được axítnucleic gồm: ADN và ARN: - Nếu mục tiêu là thu ADN, chúng cần phải loại bỏ ARN. Để loại bỏ ARN, ta dùng enzym RNase. Enzym RNase sẽ cắt ARN thành những mảnh vụn, do vậy sau khi ly tâm ADN lắng tủa và được giữ ở đáy ống nghiệm, còn những mảnh vụn ARN vẫn nằm trong dung dịch, bởi vậy khi loại bỏ dung dịch thì ARN cũng bị loại bỏ theo. - Ngược lại nếu cần loại bỏ ADN, chúng ta dùng enzym DNase, cũng tương tự như việc loại bỏ ARN, ADN sẽ bị cắt vụn bởi DNase và chúng cũng bị loại bỏ cùng dung dịch - Nước cất và TE: Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cấtkhử trùng hoặc dung dịch TE. Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn,nếu nó được hoà tan trong dung d ...