Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây bệnh xanh lùn (CLRDV) trên cây bông

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách dòng và giải trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây bệnh xanh lùn trên cây bông ở Việt Nam, kích thước gen được phân lập khoảng 606 bp. Trình tự gen CP phân lập từ CLRDV ở Việt Nam có độ tương đồng 98,2- 99,2% so với các trình tự gen được công bố trên ngân hàng gen quốc tế.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây bệnh xanh lùn (CLRDV) trên cây bôngNgô Mạnh Dũng và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ119(05): 151 - 155TÁCH DÕNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)CỦA VIRUS GÂY BỆNH XANH LÙN (CLRDV) TRÊN CÂY BÔNGNgô Mạnh Dũng1*, Chu Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn21Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên2Viện Công nghệ sinh học, VSATTÓM TẮTCây bông là loại cây trồng lấy sợi có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới. Trong khoảng 20 loạivirus gây bệnh trên cây bông, bệnh xanh lùn là bệnh có thể gây thiệt hại nặng nề nhất trên thế giới.Nguyên nhân gây bệnh xanh lùn đã được xác định là do virus gây bệnh xanh lùn (Cotton leaf rolldwarf virus - CLRDV) thuộc họ Luteoviridae, chi Polerovirus gây ra. Trong nghiên cứu này,chúng tôi đã tiến hành tách dòng và giải trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây bệnhxanh lùn trên cây bông ở Việt Nam, kích thước gen được phân lập khoảng 606 bp. Trình tự gen CPphân lập từ CLRDV ở Việt Nam có độ tương đồng 98,2- 99,2% so với các trình tự gen được côngbố trên ngân hàng gen quốc tế.Từ khóa: Bệnh xanh lùn, cây bông, CP-CLRDV, E. coli DH5 , RT-PCRĐẶT VẤN ĐỀ*Trên thế giới, cây bông được trồng ở nhiềunước có điều kiện khí hậu nhiệt đới và cậnnhiệt đới và là một trong những loại cây trồnglấy sợi quan trọng nhất. Trong khoảng 20 loạivirus gây bệnh trên cây bông, bệnh xanh lùnlà bệnh có thể gây thiệt hại nặng nề nhất nhấttrên thế giới [1]. Bệnh xanh lùn đã được pháthiện tại nhiều nước trồng bông thuộc ChâuPhi, Châu Á và Nam Mỹ,…Đối với cây bông ở Việt Nam, bệnh xanh lùnlà bệnh gây thiệt hại nhiều nhất. Bệnh đượcphát hiện lần đầu tiên tại Nha Hố (NinhThuận) vào năm 1984-1985 nhưng chưa gâyhại đáng kể. Sau đó tác hại của bệnh tăng dần.Năm 1991, Ninh Thuận xảy ra đợt dịch đầutiên, tại Nha Hố trên 80 ha trồng bông bị bệnhvới tỉ lệ 50-100%, gây thiệt hại hơn 50% sảnlượng bông.2010, Distéfano sau khi nghiên cứu hoànchỉnh trình tự bộ gen của virus bệnh xanh lùntrên cây bông, CLRDV, khẳng định đây làmột thành viên mới của chi Polerovirus [5].Đến nay, đối với cây bông, biện pháp hiệuquả nhất là sử dụng công nghệ gen trongphòng chống, tạo ra các giống cây trồng cókhả năng kháng bệnh. Trong nghiên cứu này,chúng tôi tiến hành tách dòng và giải trình tựgen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gâybệnh xanh lùn trên cây bông nhằm tạo tiền đềcho những nghiên cứu tạo cây bông chuyểngen kháng bệnh virus xanh lùn sau này.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPVật liệuNguồn bệnh virus: Lá bông nghi nhiễm bệnhxanh lùn do Viện Nghiên cứu và Phát triểncây bông Nha Hố cung cấp.Nguyên nhân gây bệnh xanh lùn là do virusgây ra. Năm 2005, Correa và cộng sự thôngqua phân lập, xác định và so sánh trình tự củagen vỏ và một phần của gen RdRp đã khẳngđịnh được virus gây bệnh xanh lùn là thuộchọ Luteoviridae, có khả năng xếp vào chiPolerovirus và đã đặt tên virus này là Cottonleafroll dwarf virus (CLRDV) [4]. Đến nămCác hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều làhóa chất tinh khiết dùng trong phòng thínghiệm về sinh học phân tử (hóa chất của cáchãng Sigma, Invitrogen, Fermentas…).*5‟-CTCGAGTTTTGGATTGTGGAATTGG-3‟Tel: 0979 722412, Email: dungmnsptn@gmail.comTrình tự các mồi để phân lập gen:CP-CLRDV-F:5‟-AATTCATGAATACGGTCGTGGGTA-3‟CP-CLRDV-R:151Ngô Mạnh Dũng và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆPhương phápTách chiết RNA tổng số thực hiện theophương pháp của Napoli và cộng sự (1990).cDNA được tổng hợp theo kít “RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit”(Fermentas).Phản ứng cDNA thực hiện trong thể tích 20l gồm có các thành phần sau: 10 ng - 5 gRNA tổng số; 250ng mồi ngẫu nhiên. Bổsung nước khử ion có xử lý DEPC tới thể tích12 l. Ủ 70°C/5 phút, sau đó đặt vào đá. Tiếptục bổ sung các thành phần vào ống phản ứngtrên: 4 l đệm RT 5X tổng hợp cDNA; 1 lriboLock Ribonuclease inhibitor (20u/ l); 2l dNTP (10 mM). Hỗn hợp sau đó đảo và lytâm nhẹ; ủ 25°C/5 phút. Tiếp tục bổ sung 1 lenzyme RevertAid (200/ l) và thực hiện mộtchu trình nhiệt như sau: 25°C/10‟, 42°C/60‟,72°C/10‟, 40°C/10‟.Các đoạn gen quan tâm, chu kỳ nhiệt: 94°C /3‟, 25 chu kỳgồm 94°C/40s, từ 50-56°C /40s tùy thuộc vàonhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi,72°C/1‟30s, 72°C/10‟ và kết thúc ở 4°C. Sảnphẩm được kiểm tra trên gel agarose 0,8 % .động ABI PRIM3100 Avant GeneticAnalyzer bằng cách sử dụng bộ hoá chấtbigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNNhân bản gen của CLRDV bằng RT-PCRRNA tổng số từ mẫu bông nghi nhiễm bệnhsau khi tách chiết được sử dụng làm khuôn đểtổng hợp cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược(Reverse transcriptase) với cặp mồi ngẫunhiên dài 6 nucleotide (random primer) (theobộ Kit của Fermentas). cDNA sau đó đượclàm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại cácđoạn DNA mang gen mã hoá cho protein vỏ(CP) của CLRDV với cặp mồi được thiết kếđặc hiệu.Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên hình 1cho thấy sản phẩm RT-PCR rất đặc hiệu, chỉ1 ...