Tái bản, sữa chữa DNA

1. Chứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo tồn Thí nghiệm của Meselson & Stahl * Thí nghiệm sơ khởi:- Ống nghiệm 1: Ly tâm siêu tốc DD CsCl (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 gradien tỷ trọng (tỷ trọng tăng dần về hướng đáy ống nghiệm).- Ống nghiệm 2: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ trọng nặng nằm gần đáy ống nghiệm.- Ống nghiệm...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tái bản, sữa chữa DNABài 7: Taùi baûn DNA vaø söûa chöõa DNA1. Chứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo toàn2. Caùc ñaëc tính vaø yeáu toá thieát yeáu cuûa söï taùi baûn3. Cô cheá cuûa söï taùi baûn4. Söï taùi baûn ôû teá baøo chaân haïch5-Söûa chöõa DNA• Nguyên phân (tạo 2 tế bào con) & giảm phân (tạo 4 tế bào con) đều cần sự nhân đôi nhiễm sắc thể → cần nhân đôi DNA (tái bản)• 1. Chứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo tồnThí nghiệm của Meselson & Stahl * Thí nghiệm sơ khởi:- Ống nghiệm 1: Ly tâm siêu tốc DD CsCl (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 gradien tỷ trọng (tỷ trọng tăng dần về hướng đáy ống nghiệm).- Ống nghiệm 2: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ trọng nặng nằm gần đáy ống nghiệm.- Ống nghiệm 3: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 14N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ trọng nhẹ nằm giữa ống nghiệm.- Ống nghiệm 4: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N và DNA 14N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 2 lớp tương ứng với 2 lớp trong ống nghiệm 1&2• Kỹ thuật ly tâm theo Gradien mật độ:• Mật độ hay tỷ trọng là khối lượng hay số hạt của 1 chất trong 1đơn vị thể tích (gr/cm3). Tỷ trọng là số đo độ chặt của các chất.• DD CsCl ly tâm siêu tốc, các ion Cesium hướng về đáy ống ( tạo 1 Gradien mật độ hay thang tỷ trọng - ion Cesium nhiều ở đáy ON).• Mỗi DNA lắng thành 1 lớp tương ứng theo tỷ trọng của nó (DNA 15N ở dưới và DNA 14N ở trên) * Thí nghiệm của Meselson & Stahl Nuôi VK E.coli trong MT chứa 15N lànguồn đạm duy nhất, sau 1 thời giantrích DNA nghiên cứu. Chuyển VKE.coli sang MT chứa 14N là nguồn đạmduy nhất để đủ 1 lần phân chia tế bào,trích DNA nghiên cứu. Tương tự nuôitiếp E.coli trong MT chứa 14N để đủ 2,3lần phân chia tế bào, trích DNA nghiêncứu. Ghi nhận và giải thích kết quả. Trong MT chứa 15N, DNA của E.colichứa 15N lắng thành 1 lớp như ốngnghiệm 1. Chuyển sang MT chứa 14N, ởlần phân bào thứ 1 có duy nhất 1 lớpDNA lai (1 mạch 15N và 1 mạch 14N ) - ởlần phân bào thứ 2 có 2 lớp gồm: 1 lớpDNA lai (50%) và 1 lớp DNA 14N (50%) -ở lần phân bào thứ 3 cũng có 2 lớpgồm: 1 lớp DNA lai (25%) và 1 lớp DNA14 N (75%). Kết luận DNA tự nhân đôitheo kiểu bán bảo toàn.• 2. Các đặc tính và yếu tố thiết yếu của sự tái bản• Các đặc tính∀ • Theo cơ chế bán bảo toàn∀ • Phát triển theo hai hướng từ OriC∀ • Sự gắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, theo cách đối song (với sợi cha-mẹ) và bắt cặp bổ sung∀ • Không liên tục trên một trong hai sợiCơ chế bán bảo toànCơ chế bán bảo toàn DNA con cĩ mang 1 mạch đơn của cha- mẹ và 1 mạch đơn mới cĩ các nucleotide lấy từ mơi trường (TN chứng minh của Meselson & Stahl). Như vậy DNA con cĩ mang 1 mạch cũ và 1mạch mới (bán bảo tồn).Phát triển theo hai hướng từ OriCGắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, đối song• Phát triển theo hai hướng từ OriCĐiểm khởi đầu của sự tái bản là OriC * Ở SV Procaryote: DNA 2 sợi vịng cĩ 1 điểm khởi đầu cố định là OriC (đánh dấu trên pt DNA của vi khuẩn E.coli bằng 1 đoạn DNA của virus µ). Đơn vị sao chép gọi là Replicon, VK cĩ 1 Replicon * Ở SV Eucaryote: DNA 2 sợi thẳng cĩ nhiều điểm khởi đầu. SV Eucaryote cĩ nhiều Replicon. TD ở Người cĩ 20- 30.000 điểm khởi đầu và mỗi Replicon khoảng 100-200kbBắt cặp bổ sung Các base của 2 mạch đối diệnbắt cặp theo nguyên tắc bổsung A với T(2 cầu nốiHydrogen) và C với G T(3 cầunối Hydrogen)• *Sự gắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, theo cách đối song (với sợi cha-mẹ):• Ở mạch mới sự kéo dài chuỗi theo hướng 5’→ 3’ (dọc theo hướng 3’→ 5’ của sợi khuôn)• Sợi khuôn 3’ 5’• Mạch mới 5’ 3’• Sợi khuôn 3’ATTGCACT………… 5’• Mạch mới 5’ TAACGT….. 3’•Không liên tục trên một trong hai sợi• Không liên tục trên một trong hai sợi• * Ở một trong 2 mạch sự tái bản từng đoạn nhỏ (Khoảng 1968-1972, Okazaki & csv phát hiện - gọi là đoạn Okazaki (cĩ kích thước 1000 - 2000 pb) * DNA Ligase nối các đoạn Okazaki• Các yếu tố thiết yếu• (1) Các nucleoside triphosphate: dATP, dTTP, dCTP và dGTP (nguyên liệu cho sự tái bản & nhiên liệu cung cấp năng lượng).• (2) Sợi khuôn (sợi đơn cha-mẹ): sợi sẽ được giữ trong phân tử DNA mới (bán bảo toàn).• (3) Mồi RNA (do DNA Primase tạo): là 1 đoạn RNA gồm 4-12 nucleotide, giúp DNA pol III kéo dài chuỗi polynucleotide• (4) Các enzyme và protein, bao gồm:• Helicase: enzyme mở xoắn• DNA Gyrase: cản sự xoắn trở lại• DNA Primase: tạo đoạn mồi RNA• DNA pol III kéo dài sợi DNA đang tăng trưởng• DNA pol I loại đoạn mồi RNA và tổng hợp đoạn DNA thay đoạn mồi .• DNA ligase tạo cầu nối phosphodiester giữa hai đoạn Okazaki cạnh nhau • SSB Protein giữ sợi DNA thẳng (các sợi khơng tái bắt cặp)• Các đặc tính của các DNA polymerase∀ • Gắn nucleotide vào 3’OH của mồi và 3’OH của sợi đang tăng trưởng∀ • Kéo dài chuỗi theo hướng 5’→ 3’ (dọc theo hướng 3’→ 5’ của sợi k ...