Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về mồi PCR/PCR primer; nguyên tắc chung trong thiết kế mồi; một số phần mềm trong thiết kế mồi;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy HằngLớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam MỒI PCR/ PCR PRIMER Vũ Thị Thúy Hằng Nội dung 1. Khái niệm 2. Nguyên tắc chung trong thiết kế mồi 3. Một số phần mềm trong thiết kế mồi https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 1 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam PCR: công nghệ làm thay đổi thế giớiThe Polymerase Chain Reaction (PCR) làm cuộc cách mạng trong khoa học sự sống vì cho phép nhân bản một số lượng lớn DNA một cách thuận tiện, hiệu quả, và có độ cậyĐược phát minh năm 1983 bởi Kary Mullis, dành giải Nobel năm 1993Kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi khi phát hiện ra Taq polymerase, một DNA polymerase trong vi khuẩn Thermus aquaticus, bền với nhiệt.Nguyên liệu chính dùng trong PCR: - DNA nucleotides: thành phần hình thành nên đoạn DNA mới - DNA khuôn: trình tự/đoạn DNA muốn nhân bản - Primers/Mồi: đoạn DNA mạch đơn gồm 16--50 nucleotide bắt cặp bổ sung với một vùng ngắn ở 2 đầu của đoạn DNA khuôn - DNA polymerase: enzyme bền với nhiệt độ dùng để tổng hợp đoạn DNA mới Mồi – quyết định thành công của phản ứng PCR Đặc hiệu/ Chuyên biệt? Gắn với DNA khuôn https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 2 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 1. Khái niệm Mồi là đoạn nucletotit ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5’ hay 3’ của DNA mạch khuôn Thiết kế mồi là tạo ra một đoạn trình tự nucleotit ngắn sử dụng trong nhân bản một vùng đặc hiệu của DNA. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã biết nằm ở 2 đầu đoạn gen cần nhân bản Mồi thiết kế được dùng để : - Tìm gen mới - Xây dựng công cụ để nhận biết, phân biệt - Tối ưu sản phẩm PCR https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 3Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 2. Nguyên tắc chung khi thiết kế mồi Trước khi thiết kế mồi – Đừng phát minh lại bánh xe! https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 4 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Trước khi thiết kế mồi – Tìm kiếm và sử dụng đúng nguồn thông tin!  Mồi thiết kế dùng để làm gì? Nhân bản DNA nói chung? Phát hiện sự khác nhau ở cấp độ từng nucleotide/SNPs? Nghiên cứu về Methylation (nhóm methyl gắn vào và làm DNA thay đổi chức năng) Trong PCR để định lượng được DNA nhân bản (Real-time PCR) Làm mồi dò cho microarray? Cho nhiều PCR trong cùng một phản ứng (sử dụng nhiều mồi)  Bắt đầu từ đâu? Trình tự DNA mạch đơn/ Trình tự protein? Nhiều file trình tự DNA/protein? Ngân hàng gen (GenBank ID/Gene ID/Gene Symbol/rsSNP ID? Sau đó, xem xét một số lựa chọn! Hầu hết các mồi có thể được thiết kế từ một số phần mềm khác nhau Các phần mềm khác nhau có thể cho kết quả khác nhau, chủ yếu về: Cách tiếp cận Tiêu chí thiết kế và mặc định (Designing criteria and default settings) Tính toàn diện Tính năng sử dụng Tốc độ Xem xét đến lựa chọn thứ 2 khi: Bạn mới lần đầu thiết kế Bạn không có nhiều sự tự tin trong lựa chọn kết quả https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 5 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Những nguyên tắc chung trong thiết kế mồi Khi thiết kế mồi phải xem xét đến các yếu tố:  Chiều dài của mồi và của đoạn nhân bản  Nhiệt độ chảy  Nhiệt độ gắn mồi  Tính đặc hiệu/chuyên biệt và tránh tương đồng chéo  Hàm lượng GC; trình tự chạy và trình tự lặp  Tránh tương tác giữa mồi – mồi hình thành cấu trúc bậc 2  Kẹp GC (GC clamp) Chiều dài của mồi và đoạn nhân bản Chiều dài mồi quyết định tính đặc hiệu và ảnh hưởng lớn đến nhiệt độ gắn mồi: Quá ngắn: tính đặc hiệu kém, dẫn đến nhân bản cả các đoạn không đặc hiệu Quá dài: giảm hiệu quả gắn với DNA khuôn ở nhiệt độ gắn mồi bình thường do tăng xác suất hình thành cấu trúc bậc hai. Chiều dài tối ưu 18-24 bp cho PCR thông thường 30-35 bp cho nhiều PCR trong một phản ứng Chiều dài đoạn DNA nhân bản tối ưu 300-1000 bp cho PCR thông thường, tránh > 3 kb 50-150 bp PCR để định lượng, tránh > 400 bp https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 6 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Chiều dài mồi Xác suất tìm thấy 1 nucleotit A, G, C, T trong một trình tự DNA là: 1/4 (4-1) Xác suất tìm thấy trình tự có 2 nucleotit liền nhau (vd AG) tr ...