Bài giảng Xu hướng phát triển thực phẩm: Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen

Bài giảng "Xu hướng phát triển thực phẩm: Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen" trình bày các nội dung chính sau: Các bước chính tạo GMO; Các kỹ thuật gen cơ bản; Chọn gen mục tiêu và sinh vật cho gen;... Mời quý thầy cô và các em cùng tham khảo bài giảng!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Xu hướng phát triển thực phẩm: Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi genCác kỹ thuật gen sửdụng trong tạo sinh vật biến đổi gen THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN Nguyễn Tiến Thành - HUSTLàm thế nào tạo ra GMO Gen Tế bào sinh vật Tế bào sinh vật mang gen chuyển bình thường (GMO)Các bước chính tạo GMO Lựa chọn gen tách gen từ sinh Thiết kế cấu trúc và sinh vật cho vật cho gen, biểu hiện gen gen “tách dòng” kháng sâu đục thân cry Promoter-cry-Terminator cry từ Bacillus Sàng lọc tế bào Đưa gen lên các Chuyển gen vào đạt yêu cầu phương tiên tế bào đích chuyển Chọn cá thể ngô có Sún g bắn gen vào hạt vàn g đặc điểm khán g sâu ngôCác kỹ thuật cơ bảnu Tách chiết, tinh sạch DNA hệ genu Khuếch đại DNAu Cắt và ghép nối DNAu Chuyển (Biến nạp) DNA vào tế bào vật chủu Các phương pháp đánh giá kết quả chuyển genChọn gen mục tiêu và sinh vật chogenu Thường là các gen tạo cho sinh vật nhận các đặc tính mới : u Kháng sâu đục thân: cry từ Bacillus thurigensis u Kháng thuốc trừ cỏ: bar từ Streptomyces, espsp từ Agrobacterium… u Hormon sinh trưởng: từ cá hồi Chinok u Etc..u Cần rõ trình tự DNA, đặc biệt là vùng mã hóa cho protein ̀ tương ứngTách gen từ sinh vật chou Phương pháp chủ đạo là ”câu” và nhân gen (khuếch đại gen) từ DNA hệ gen của sinh vật cho gen: u Tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen. Trường hợp sinh vật cho gen là virus thì cần tạo cDNA từ RNA của virus u Nhân gen từ DNA hệ gen đã tách chiết được Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen Phương pháp nhân genPhương pháp tách/tinh sạch DNAhệ genu Mục đích: thu DNA nguyên vẹn (không bị cắt đoạn, gẫy), không lẫn các thành phần khác (protein…), hiệu suất thu hồi caou Nguyên tắc chính: u Phá màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA u Tách DNA ra khỏi các thành phần khác u Thu nhận DNAPhương pháp tách chiết/tinhsạch DNAu Phá màng tế bào, màng nhân: kết hợp 2 phương pháp u Cơ học: nghiền trong Ni tơ lỏng, siêu âm, rung lắc với bi thuỷ tinh u Hoá học: lyzozyme (enzyme phân giải màng peptidoglycan), SDS (giãn mạch protein), proteinase (thuỷ phân protein, tách DNA khỏi protein), Rnase (phân giải RNA)u Tách DNA khỏi thành phần khác: 1 trong 2 phương pháp u Trích ly bằng phenol – chloroform để thu protein, DNA trong pha nước u Sử dụng cột silica, bám đặc hiệu DNAu Thu nhận DNA u Kết tủa bằng isopropanol, ly tâm thu kết tủa u Rửa giải DNA trên màng silica thu DNATách chiết DNA Phương pháp nhân genu PCR: polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp, dựa trên đặc tính của DNA và khả năng tổng hợp chuỗi của DNA polymerase trên chuỗi khuôn từ các mồi bổ sung ban đầu (xem tái bản gen)u Cần có: u Đoạn DNA gốc cần nhân lên u Các nucleotide A, T, G, C tự do u Enzyme DNA polymerase u Các mồi: 2 mồi: xuôi và ngược ứng với 2 mạch đơn DNA u Thiết bị luân nhiệtu Kết quả: từ 1 đoạn DNA kép gốc tạo ra số lượng vô cùng lớn các đoạn DNA kép giống với DNA gốc Phương pháp nhân genNguyên tắc phản ứng PCRĐoạn DNAban đầu Mồi Các nucleotide Biến tính tại 94 –96oC Bắt cặp tại 55 - 65oC Kéo dài tại 72oCPhương pháp nhân gen PCRu Thiết kế mồi: u Mồi quyết định sản phẩm PCR u Để thu đúng sản phẩm, mồi cần được thiết kế dựa trên đoạn gen cần ”câu” và nhân lên từ DNA à cần trình tự của đoạn gen cần “câu” ra u Mồi cần có chiều dài đủ để sự bắt cặp mồi với DNA đích đúng: 20 -25 nt u Tỷ lệ GC tốt nhất là 50%.u Tổng hợp mồi: công ty bên ngoài thực hiệnPhương pháp nhân gen PCRu Thực hiện trong các thiết bị luân nhiệt: ở các nhiệt độ khác nhau (95oC, 60oC, 72oC), trong thời gian khác nhau, lặp lại chu trình nhiều lầnPhương pháp nhân gen PCRu Kiểm tra sản phẩm nhân gen: sử dụng điện di trên agaroseu Sản phẩm nhân gen được đưa vào agarose, đặt trong điện trường, DNA sẽ di chuyển tùy thuộc và kích thước của nó (nhỏ thì nhanh, lớn thì chậm) à nếu là hỗn hợp nhiều DNA kích thước khác nhau, sau một thời gian sẽ phân tách được chúng.u Quan sát sự phân bố các sản phẩm DNA dưới tia UV với sự hỗ trợ của ethidium bromide (EtBr) Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng điện di trên agarose Điện trường Điện tích âmDNA từ DNAphản phânứng táchnhân theo Chấtgen kích hiện Đưa vào các đường thước màu chạy trên Agarose, có kèm DNA chuẩn Điện tích dương biết kích thước Hiện sản phẩm dưới UV ...