CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 9

Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là TDNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc (oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 9 182 Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T-DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc(oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormoneauxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sựphân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzymeđiều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đườnggọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopinesynthetase và nopaline synthetase. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trongviệc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNAmã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡngcacbon và nitrogen cho vi khuẩn.2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trậttự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) vàbiên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biênnày đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cầnthiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quátrình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB.Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệuquả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọngtrong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzymeAMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vàosinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamidhydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triểncủa tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm nàyđược sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn cáctế bào không được biến nạp.2.1.1.3. Vùng vir Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyểnT-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, cònvirC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, cácoperon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điềukiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rấtmạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operonnày có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết 183ra từ vết thương của cây. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã t inhchiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alphahydroxyacetosyringon.2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạthoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khiAgrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từvết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast. Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA(protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium,đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môitrường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việcphosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huynằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy,protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã củachính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắtTi-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư củamạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA đượcgiải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới đượctổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điềunày giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA.Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nóitrên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cườngnhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virCmã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ralàm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phứchợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium.Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối,cho phức hợp trên chuyển từ Agro ...