Định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Nghiên cứu này nhằm thẩm định quy trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Các acid amin trong mẫu thử được dẫn xuất bằng AQC (6 - aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển thành các chất có thể phát hiện được bằng đầu dò cực tím (UV), phân tách các dẫn xuất AQC của acid amin bằng phương pháp UPLC, định lượng bằng đầu dò TUV.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG DỊCH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG Lê Duy Cường1, Trần Thị Chi Mai2 1 Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, 2Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu này nhằm thẩm định quy trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Các acid amin trong mẫu thử được dẫn xuất bằng AQC (6 - aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển thành các chất có thể phát hiện được bằng đầu dò cực tím (UV), phân tách các dẫn xuất AQC của acid amin bằng phương pháp UPLC, định lượng bằng đầu dò TUV. Giới hạn định lượng của phương pháp là 5 µmol/L. Khoảng tuyến tính của phương pháp là từ 5 đến 1000 µmol/L. Độ chính xác ngắn hạn CV ≤ 2,4%, độ chính xác dài hạn CV ≤ 3%. Qui trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp UPLC chính xác và xác thực, có thể sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị các rối loạn chuyển hoá bẩm sinh. Từ khoá: acid amin, dịch sinh học, sắc ký lỏng siêu hiệu năng, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh I. ĐẶT VẤN ĐỀ Định lượng acid amin tự do trong máu và thần kinh, bệnh tim mạch, kháng insulin, nước tiểu là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh lý, dược lý, nuôi cấy tế bào chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa và phân tích giá trị dinh dưỡng ở thực phẩm bẩm sinh. Sử dụng phân tích acid amin tự do [3; 4; 5]. trong chương trình sàng lọc sơ sinh đã cho phép chẩn đoán nhanh một số rối loạn chuyển hóa bẩm sinh như bệnh phenylceton niệu, MSUD (maple syrup urine disease), một số rối loạn trong chu trình urê, bệnh homocystine niệu [1; 2]. Việc theo dõi cẩn thận và duy trì nồng độ acid amin trong máu ở mức tối ưu ở những bệnh nhân này sẽ mang lại những lợi ích lâu dài trong điều trị. Bên cạnh ứng dụng trong đánh giá tình trạng dinh dưỡng ở bệnh nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, định lượng acid amin tự do trong các dịch sinh vật khác còn được áp dụng trong một số nghiên cứu như: tình trạng suy tế bào gan, bệnh lý ung thư, chuyển hóa cơ, rối loạn dẫn truyền Theo các báo cáo từ Khoa Nội tiết và Rối loạn chuyển hóa Bệnh viện Nhi Trung ương trong vài năm gần đây, số trẻ mắc các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh với tỷ lệ 1/5000 trẻ sinh ra, trong đó tỷ lệ tử vong lên đến 48%. Đồng thời việc xét nghiệm chẩn đoán rất khó khăn, các mẫu bệnh phẩm định lượng acid amin tự do phải gửi ra nước ngoài dẫn đến kết quả xét nghiệm rất chậm. Ở Việt Nam, có nhiều bệnh nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh nhưng không được chẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến những di chứng nặng nề [1]. Trên Thế giới, định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu đã được tiến hành từ những năm đầu thập niên 60 của thế kỷ XX [6; 7]. Phương Địa chỉ liên hệ: Lê Duy Cường, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Email: v.cuongdl@vinmec.com pháp phổ biến nhất được sử dụng là sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất hậu cột bằng Ngày nhận: 25/7/2016 ninhydrin. Đây là phương pháp có ưu điểm rẻ Ngày được chấp thuận: 18/12/2016 tiền, dễ sử dụng. Tuy nhiên, sắc ký trao đổi 62 TCNCYH 102 (4) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ion có nhược điểm là thời gian phân tích dài Mẫu thử được khử protein bằng dung dịch (120 phút/mẫu) và đòi hỏi về bảo trì phức tạp acid sulfosalicylic (SSA) 10% chứa nội chuẩn nên kỹ thuật này trở nên không phù hợp với norvaline 250 µM với thể tích tương đương, ly các phòng xét nghiệm [2,8,9] tâm dung dịch trong thời gian 5 phút ở tốc độ Trong những năm gần đây, một phương pháp mới đã được ứng dụng để thay thế cho phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultraperformance liquid chromatography - UPLC). So với sắc ký trao 13000 vòng/phút, thu dịch nổi và tiến hành tạo dẫn xuất theo quy trình của nhà sản xuất. Phương pháp phân tích acid amin bao gồm các giai đoạn sau: (1) Kiềm hoá mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu đổi ion, phương pháp UPLC có ưu thế vượt trắng (blank) đã được khử tạp bởi SSA bằng trội ở hiệu năng và rút ngắn được thời gian dung dịch NaOH/ borat. phân tích [8; 9; 10]. Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương đã được trang bị hệ thống (2) Phản ứng tạo dẫn xuất: Dẫn xuất hoá UPLC nhằm phân tích acid amin tự do trong các acid amin trong mẫu thử bằng AQC (6 - các dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán, aminoquinolyl sàng lọc, theo dõi điều trị một số rối loạn carbamate) để chuyển các acid amin bậc một chuyển hóa bẩm sinh. Để có thể áp dụng thiết bị UPLC vào phân tích acid amin tự do, cần - N - hydroxysuccinimidyl và bậc hai thành các chất có thể phát hiện được bằng đầu dò cực tím (UV). phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào (3) Phân tách các dẫn xuất AQC của acid sử dụng. Do đó, đề tài được tiến hành với amin bằng phương pháp UPLC, định lượng mục tiêu: Thẩm định quy trình định lượng acid bằng đầu dò TUV. amin tự do trong máu và nước tiểu bằng ...