Giáo trình miễn dịch học ứng dụng part 3

Vacxin virus chế trên môi trường nuôi cấy tế bào Ví dụ: Thường quy sản xuất một loại vacxin sống giảm độc trên tế bào thận khỉ Vacxin sống giảm độc được sản xuất từ virus được nhiễm vào lớp tế bào thận khỉ tiên phát, tế bào thận khỉ được lấy ra bằng phương pháp trypsin hóa. . Tách tế bào thận khỉ bằng phương pháp truyền dịch Khỉ dùng cho sản xuất là giống khỉ Maccaca muldatta; Cân nặng 2 - 3 kg, 2 - 2,5 năm tuổi; Không có tác nhân ngoại lai SV40, SIV, STLV; Không...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình miễn dịch học ứng dụng part 3 Vacxin virus chế trên môi trường nuôi cấy tế bào Ví dụ: Thường quy sản xuất một loại vacxin sống giảm độc trên tế bào thận khỉ Vacxin sống giảm độc được sản xuất từ virus được nhiễm vào lớp tế bào thận khỉ tiên phát, tế bào thận khỉ được lấy ra bằng phương pháp trypsin hóa. . Tách tế bào thận khỉ bằng phương pháp truyền dịch Khỉ dùng cho sản xuất là giống khỉ Maccaca muldatta; Cân nặng 2 - 3 kg, 2 - 2,5 năm tuổi; Không có tác nhân ngoại lai SV40, SIV, STLV; Không có kháng thể polio; Cách ly kiểm dịch 6 tuần. * Mổ lấy thận (vô trùng): Gây mê sâu bằng ketamin liều 10 - 20mg/kg P, cắt động mạch cổ, tắm bằng xà phòng và cloramin, lột da bụng, mổ bộc lộ thận, bóc tách thận, đảm bảo không gây tổn thương nhu mô thận. Bảo quản thận trong bình có 100ml môi tr ờng LHE hoặc Hanks ủ ấm 370C. ư * Tripsin hóa: Lấy thận đặt vào đĩa petri, lu ồn kim vào động mạch thận, truyền dung dịch versen 150ml - 200ml vào động mạch thận với tốc độ 15 - 20ml/phút đẩy máu đọng trong nhu mô, tiếp theo truyền 150 - 200ml dung dịch tripsin với tốc độ trên cho tới khi thấy dịch chảy ra ngoài nhớt; nhu mô thận xuất hiện vết nứt. Cho thận vào bình chứa 80 - 100ml môi trường LHE, lắc nhẹ đến khi môi trường hóa đục (tế bào được tách ra) - hỗn dịch tế bào được thu giữ lại trong bình có 100 - 150ml huyết thanh bê và giữ trong lạnh. Tiếp tục tripsin hóa cho đến khi nhu mô thận tan hết. Hỗn dịch tế bào được cho thêm LHE vừa đủ 1000 - 1500ml sao cho nồng độ huyết thanh bê đạt 10% và bảo quản lạnh 4 - 80C cho đến khi nuôi cấy. + Kiểm tra vô trùng. + Đếm tế bào: Pha tế bào bằng xanh trypan với tỷ lệ 1,5 lần, đếm bằng buồng đếm hồng cầu trên kính hiển vi phản pha. + Tiêu chuẩn chấp nhận: - Hỗn dịch tế bào đồng nhất; - Tỷ lệ sống trên 80%; - Lượng tế bào đủ nuôi cấy trên 100 bình Roux. . Nuôi cấy tế bào Pha tế bào bằng môi trường phát triển LHE để đạt nồng độ 70.000 tế bào/1ml. Môi trường LHE gồm: 50% LH 0,5% + 50% Eargle + NaHCO3 0,025% + huyết thanh bê 7 - 10% + kháng sinh; nuôi cấy vào các bình Roux dung tích 1200 ml, diện tích nuôi cấy 250cm2, khối lượng 170ml hỗn dịch tế bào đã pha loãng. Nuôi cố định ở 370C trong 4 - 5 ngày, thay môi trường bằng môi trường duy trì có 2 - 5% huyết thanh bê. Tiếp tục nuôi 3 - 4 ngày để tế bào mọc kín một lớp. Kiểm tra sự phát triển của tế bào hàng ngày. * Tiêu chuẩn chấp nhận: - Tế bào mọc kín 1 lớp; - Không nhiễm khuẩn; - Số tế bào trong 1 chai khoảng 30 - 40 triệu. . Gây nhiễm virus Gây nhiễm virus là giai đoạn chính, quan trọng nhất trong quá trình sản xuất vacxin nói chung. Mỗi chủng virus có một nồng độ gây nhiễm riêng đảm bảo thu được vacxin an toàn, đạt hiệu quả cao nhất. - 38 - * Pha loãng giống vacxin: Tính số lượng virus cần gây nhiễm trong lô sản xuất. Ví dụ : Với vacxin Bại liệt : Dùng chủng gốc virus bại liệt typ I: WHO - IS - 90C do viện nghiên cứu bại liệt Nhật Bản cung cấp, chủng có nguồn gốc từ chủng Sarbin (SO) được cấy truyền 2 lần (SO+2) hiệu giá 108,3TCID50/ml. Pha loãng với LH3E, với khối lượng cần thiết. * Rửa tế bào - Loại bỏ hết môi trường trong chai tế bào; - Cho vào mỗi chai 100ml Hank’s láng qua, lắc nhẹ, hút hết dịch rửa Hank’s; - 25% số chai tế bào chọn ngẫu nhiên làm đối chứng. * Gây nhiễm: Cho vào mỗi chai 3ml hỗn dịch giống bằng bơm tự động, láng đều hỗn dịch virus lên bề mặt tế bào. * Hấp phụ virus: Toàn bộ số chai tế bào gây nhiễm và chai đối chứng được để hấp phụ ở 33,50C/1 giờ. Cứ 15 phút láng nhẹ 1 lần hỗn dịch virus trên toàn bộ bề mặt chai tế bào. * Bổ sung môi trường: Cho vào mỗi chai 110 - 120ml LH3E nuôi ở 33,30C, theo dõi sự hủy hoại tế bào. Những chai được thu hoạch khi trên 80% tế bào bị hủy hoại với mức CPE3+ đến 4+. . Thu hoạch vacxin Thu hoạch vacxin đúng quy trình sẽ mang lại hiệu quả cao nhất trong sản xuất. * Kiểm tra tế bào đối chứng: Môi trường vàng cam, trong suốt, tế bào bám đều khắp bề mặt chai, tế bào không bị thoái hóa. * Kiểm tra các chai gây nhiễm virus: - Môi trường có màu vàng sẫm, trong suốt; - Soi trên kính hiển vi thấy có hiện tượng hủy hoại: Tế bào co tròn, bong khỏi thành chai (3+: hầu hết tế bào thoái hóa; 4+: tế bào bong hết khỏi thành chai). * Thu hoạch: Thời gian thu hoạch khoảng 65 - 90 giờ sau gây nhiễm. Dùng tay lắc mạnh chai cho tế bào bong hết khỏi thành chai, bảo quản trong tủ - 200C. Ta thu được vacxin bán thành phẩm. Thử vô trùng bán thành phầm. * Tập trung vacxin: - Lấy chai tế bào ra ...