Tài liệu: Tinh sạch protein

Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tài liệu: Tinh sạch protein Tinh s ch protein Gi i thi u chung I. S tinh s ch c a protein r t quan tr ng vì t protein tinh s ch chúng ta có th xác nh ư c trình t acid amin, m i liên h v ti n hóa gi a các protein trong nh ng cá th khác nhau và kh o sát các ch c năng sinh hóa c a các protein ó. Hơn th n a, vi c tinh th hóa protein ch có th th c hi n v i nh ng protein tinh s ch và t nh ng tinh th ó chúng ta s bi t ư c c u trúc b c 4 cũng như các ơn v ch c năng c a protein thông qua d li u chi u x tia X. Vì v y, quá trình tinh s ch protein không ng ng ư c c i ti n t ưc tinh s ch cao nh t nhưng nhìn chung m t quá trình tinh s ch protein cũng c n i qua các bư c căn b n sau:1. Nh n bi t protein m c tiêu2. Ly trích protein t t bào hoà tan, kích thư c, i n tích, và liên k t ái l c3. Thu nh n protein m c tiêu d a trên4. Phân tách protein b ng i n di trên gel Xác nh tr ng lư ng và kh i lư ng c a protein5. Nh n bi t protein m c tiêu II. K t qu c a s tinh s ch là m t m u protein ch ch a úng m t lo i phân t , ây là m t lo i protein mà nhà sinh hóa quan tâm. M u protein này ch là m t phân o n chi m 1% v t li u ban u, v n có th là d ch nuôi c y t bào hay m t cơ quan riêng bi t l y c a xác nh ư c protein m c tiêu t h n h p protein, nhà sinh th c v t hay ng v t. hóa c n th c hi n m t th nghi m d a vào c tính c a protein ó. N u protein m c tiêu là m t enzyme thì th nghi m s ư c th c hi n d a trên ho t tính c a enzyme ó. C th như v i enzyme lactate dehydrogenase, m t enzyme có vai trò trong vi c s n xu t năng lư ng t glucose cũng như t ng h p glucose t lactate, xác nh enzyme này thì d a trên ph n ng c a nó trong t bào Sau ó, d a vào kh năng h p th ánh sáng m nh bư c sóng 340nm c a Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có th o ư c lư ng ánh sáng ư c h p th bư c sóng 340nm trong m t ơn v th i gian xác nh ho t tính c a enzyme lactate dehydrogenase. Trên th c t vi c tìm ra m t th nghi m hi u qu thư ng r t khó, nhưng n u có ư c m t cách th nghi m càng c hi u thì quá trình tinh s ch càng hi u qu . Tuy nhiên, ch c ch n quá trình tinh s ch ho t ng t t, chúng ta còn c n m t thông s là lư ng protein có trong h n h p ư c th nghi m. Hi n nay có r t nhi u phương pháp phát hi n nhanh và chính xác n ng protein. D a vào 2 thông s th c nghi m là ho t tính enzyme và n ng protein, ta có th xác nh ho t tính riêng c a enzyme t c là t l ho t tính enzyme v i hàm lư ng protein có trong m u th nghi m. Ho t tính riêng càng cao thì quá trình tinh s ch càng hi u qu hay nói cách khác, m c tiêu c a vi c tinh s ch là làm tăng t i a ho t tính riêng. Ly trích protein t t bào III. Khi ã tìm ra th nghi m phù h p và ch n ư c ngu n protein, chúng ta c n phân o n d ch t bào thành nhi u ph n và xác nh xem ph n nào ch a nhi u protein m c tiêu. Quá trình tìm phân o n m c tiêu ư c phát tri n b ng s mày mò qua t ng thí nghi m. Bư c u tiên là phá v màng t bào, t o thành h n h p ng ch t. Sau ó phân o n h n h p b ng ly tâm, d ch n i ch a phân t có tr ng lư ng th p, nh ng phân t có tr ng lư ng cao hơn l ng xu ng áy ng ly tâm. D ch n i l i ư c ly tâm l n n a v i l c m nh hơn t o c n và d ch n i m i. Ti n trình này, ư c g i là ly tâm phân o n, s t o ư c nhi u phân o n khác nhau v i t tr ng gi m d n, m i phân o n này ch a hàng trăm phân t protein khác nhau, s ư c tinh s ch sau khi ã qua th nghi m ho t tính. Thông thư ng, m t phân o n có ho t tính cao s là ngu n v t li u cho các k thu t tinh s ch hi u qu . IV. Thu nh n protein m c tiêu d a trên hoà tan, kích thư c, i n tích, và liên k t ái l c Hàng ngàn protein ã ư c tinh s ch d ng có ho t tính d a trên nh ng c tính căn b n như hòa tan, kích thư c, i n tích và liên k t ái l c. Thông thư ng, m t h n h p protein s tr i qua nhi u giai o n phân tách, m i giai o n d a trên m t c tính nh t nh, cu i cùng là m t protein tinh s ch. m i bư c phân tách, th nghi m xác nh protein u ư c th c hi n. Lư ng áng k protein tinh ho t tính và xác nh n ng s ch, kho ng vài miligram, có th giúp ta bi t ư c c u trúc không gian ba chi u và cơ ch ph n ng c a nó. Vì v y, s n lư ng toàn ph n là m t i m quan tr ng c a quá trình tinh s ch. Các k thu t tinh s ch thư ng dùng: t a b ng mu i, màng bán d n, s c ký.IV.1 T a b ng mu i mu i cao, ph n l n protein s gi m tính hòa tan, hi n tư ng này g i là t a n ng b ng mu i (salting out). M i lo i protein s k t t a m t n ng mu i nh t nh. Vì v y, hi n tư ng t a b i mu i có th ư c dùng phân o n protein. Ví d như fibrinogen t a n ng ...