Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoán Bacillus anthracis

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp để ứng dụng trong chẩn đoán chính xác Bacillus anthacis (B. anthacis) gây bệnh ở Việt Nam bằng kỹ thuật mPCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoán Bacillus anthracisTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015THIẾT KẾ CHỨNG NỘI TẠI TÁI TỔ HỢP TRONG PHẢN ỨNGMULTIPLEX PCR CHẨN ĐOÁN BACILLUS ANTHRACISĐinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**Đoàn Trọng Tuyên***; Nghiêm Ngọc Minh****TÓM TẮTMục tiêu: thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoán Bacillusanthracis gây bệnh. Vật liệu và phương pháp: canh khuẩn 0,5 McFarland chủng B. anthacis Ba1gây bệnh lưu giữ tại Học viện Quân y được bất hoạt ở 121°C/20 phút trước khi tách chiết ADNtổng số. Phân lập chính xác một đoạn gen lef (IC1) để tạo dòng phụ pJET1.2-IC1. Qua các côngđoạn tái tổ hợp, IC1 được gắn vào vector pJET1.2-capA (sau khi cả hai được cắt bằng enzymhạn chế BamHI và NdeI) trong phản ứng lai. Chứng nội tại plasmid tái tổ hợp pJET1.2-capAIC1 được khuếch đại đồng thời trong phản ứng mPCR (chứa ba cặp mồi vrrAF1/R1,pagAF1/R1 và capAF1/R1) chẩn đoán B. anthracis gây bệnh. Kết quả và kết luận: đã thiết kếthành công một chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng mPCR chẩn đoán chính xác B. anthracis.Bổ sung chứng nội tại này vào các mẫu kiểm tra trước lúc tách chiết ADN để xác minh kết quảchẩn đoán, loại bỏ hiện tượng âm tính giả.* Từ khóa: Bacillus anthracis; Âm tính giả; Chứng nội tại; PCR chẩn đoán; PCR đa mồi;Tái tổ hợp.Development of a Recombinant Internal Amplification Control inMultiplex PCR Assay for Diagnosis of Pathogenic Bacillus anthracisSummaryObjective: To design and develop a recombinant internal amplification control in multiplex PCRassay for diagnosis of pathogenic B. anthracis. Materials and methods: Pathogenic B. anthracis0Ba1 strain was inactivated at 121 C/20 minutes before extracted genomic DNA. Lef gene (IC1) washigh fidelity amplified, cloned in pJET1.2-blunt. Using recombinant DNA techniques, gel purifiedIC1 gene and pJET1.2-capA vector products were simultaneously digested by restriction enzymesBamHI and NdeI, and then they were ligated using T4 DNA ligase to create an amplicon 1,000bp larger than the diagnostic amplicons. Internal amplification control pJET1.2-capA-IC1 wassimultaneously amplified in a multiplex PCR assay with three primer pairs including vrrAF1/R1,pagAF1/R1 and capAF1/R1 for diagnosis of pathogenic B. anthracis. Results and conclusion:* Học viện Quân y** Bệnh viện Quân y 103*** Viện Y học Dự phòng Quân đội**** Viện Nghiên cứu Hệ Gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt NamNgười phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)Ngày nhận bài: 07/04/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/06/2015Ngày bài báo được đăng: 13/07/201517TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015We designed and developed successfully a recombinant internal amplification control in amultiplex PCR assay for accurate diagnosis of B. anthracis. This internal amplification controlwas added in the samples before DNA extraction to exclude false negative results.*Key words: Bacillus anthracis; False negative; Diagnostic PCR; Internal amplification control;Multiplex PCR; Recombinant.ĐẶT VẤN ĐỀChẩn đoán phân tử, đặc biệt là cácphương pháp dựa trên PCR đã được ứngdụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như yhọc, môi trường hay khoa học hình sự...Tuy nhiên, một nhược điểm lớn trong hầuhết các công bố đều ít đề cập đến chứngnội tại (internal amplification control - IC)[6] - thành phần cần thiết và gần như bắtbuộc trong các phản ứng PCR chẩn đoán.Chứng nội tại là một đoạn axÝt nucleictinh khiết (có thể là plasmid chứa ADNhay sản phẩm PCR tinh sạch) có trình tựkhác biệt với gen đích, được khuếch đạiđồng thời cùng với ADN mẫu trong mộtống phản ứng. Mục đích của chứng nộitại là xác minh kết quả chẩn đoán, tránhhiện tượng âm tính giả, gây sai sót trongchẩn đoán [2, 5]. Do được bổ sung vàomẫu từ quá trình tách chiết axÝt nucleichay trong thực hiện PCR nên chứng nộitại có thể kiểm soát được toàn bộ quátrình chuẩn bị mẫu và thực hiện PCR(thiết bị luân nhiệt, các thành phần trongmaster mix PCR hay các chất ức chế cótrong từng mẫu cụ thể) tùy thuộc vào thờiđiểm bổ sung chứng nội tại [7].Trong chẩn đoán vi sinh phân tử, cácmẫu bệnh phẩm, thực phẩm hay môitrường có nhiều thành phần, yếu tố cạnh18tranh với vi sinh vật ảnh hưởng đến hiệuquả quá trình tách chiết cũng như PCR,đặc biệt là giảm giới hạn phát hiện và gâyhiện tượng âm tính giả. Các chất ức chếPCR có thể được tìm thấy trong dịch cơthể người, từ đất, tế bào vi khuẩn và ADNkhác không phải là ADN đích [2]. Như vậy,sự có mặt của chứng nội tại biểu hiệnbằng band có kích thước xác định xuấthiện ở tất cả các mẫu trên bản gel điện di,nhất là trong trường hợp mẫu âm (khikhông xuất hiện band đích của gen chẩnđoán), cho phép phân biệt kết quả âmtính thật và âm tính giả. Chứng nội tại cóthể được chia thành hai loại dựa vào nhucầu sử dụng mồi, đó là chứng nội tại cạnhtranh (competitive IC - sử dụng chung vớicặp mồi chẩn đoán) v ...