Tinh sạch protein

Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện vớinhững protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch protein Tinh sạch protein I. Giới thiệu chungSự tinh sạch của protein rất quantrọng vì từ protein tinh sạch chúngta có thể xác định được trình tựacid amin, mối liên hệ về tiến hóagiữa các protein trong những cá thểkhác nhau và khảo sát các chứcnăng sinh hóa của các protein đó.Hơn thế nữa, việc tinh thể hóaprotein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau:1. Nhận biết protein mục tiêu2. Ly trích protein từ tế bào3. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực4. Phân tách protein bằng điện di trên gel5. Xác định trọng lượng và khối lượng của protein II. Nhận biết protein mục tiêu Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mụctiêu là một enzyme thì thử nghiệmsẽ được thực hiện dựa trên hoạttính của enzyme đó. Cụ thể như vớienzyme lactate dehydrogenase, mộtenzyme có vai trò trong việc sảnxuất năng lượng từ glucose cũngnhư tổng hợp glucose từ lactate, đểxác định enzyme này thì dựa trênphản ứng của nó trong tế bào Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụánh sáng mạnh ở bước sóng 340nmcủa Nicotinamide adeninedinucleotide (NADH), ta có thể đođược lượng ánh sáng được hấp thụở bước sóng 340nm trong một đơnvị thời gian để xác định hoạt tínhcủa enzyme lactate dehydrogenase.Trên thực tế việc tìm ra một thửnghiệm hiệu quả thường rất khó,nhưng nếu có được một cách thửnghiệm càng đặc hiệu thì quá trìnhtinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên,để chắc chắn quá trình tinh sạchhoạt động tốt, chúng ta còn cần mộtthông số là lượng protein có tronghỗn hợp được thử nghiệm. Hiệnnay có rất nhiều phương pháp pháthiện nhanh và chính xác nồng độprotein. Dựa vào 2 thông số thựcnghiệm là hoạt tính enzyme vànồng độ protein, ta có thể xác địnhhoạt tính riêng của enzyme tức là tỉlệ hoạt tính enzyme với hàm lượngprotein có trong mẫu thử nghiệm.Hoạt tính riêng càng cao thì quátrình tinh sạch càng hiệu quả haynói cách khác, mục tiêu của việctinh sạch là làm tăng tối đa hoạttính riêng. III. Ly trích protein từ tế bàoKhi đã tìm ra thử nghiệm phù hợpvà chọn được nguồn protein, chúngta cần phân đoạn dịch tế bào thànhnhiều phần và xác định xem phầnnào chứa nhiều protein mục tiêu.Quá trình tìm phân đoạn mục tiêuđược phát triển bằng sự mày mòqua từng thí nghiệm. Bước đầu tiênlà phá vỡ màng tế bào, tạo thànhhỗn hợp đồng chất. Sau đó phânđoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổichứa phân tử có trọng lượng thấp,những phân tử có trọng lượng caohơn lắng xuống đáy ống ly tâm.Dịch nổi lại được ly tâm lần nữavới lực mạnh hơn để tạo cặn vàdịch nổi mới. Tiến trình này, đượcgọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạođược nhiều phân đoạn khác nhauvới tỉ trọng giảm dần, mỗi phânđoạn này chứa hàng trăm phân tửprotein khác nhau, sẽ được tinhsạch sau khi đã qua thử nghiệmhoạt tính. Thông thường, một phânđoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồnvật liệu cho các kỹ thuật tinh sạchhiệu quả.