ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để pháthiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và polysaccharide.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNHĐịnh nghĩa elisa ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA(Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để pháthiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Nguyên lý của phương pháp ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huyđộng hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch. Khángnguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide vàpolysaccharide. Chưa biết gắn trên bề mặt. Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin trongcác protein máu. Kháng thể là những protein hòa tan do cáctế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một khángnguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó Thêm vào một cơ chất (substance) củaenzyme đó. Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này vàtạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽđược phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên –kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp khángnguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độsáng phát ra Các bước tiến hànhĐể tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KTđặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KNđược cố định tại các giếng của vi phiếm(polystyrene microtiter plate).- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắntrực tiếp vào bề mặt của đĩa- Phương thức gắn đặc hiệu (sandwich ELISA):KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùngkháng nguyên cần kiểm tra KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa Phương thức gắn đặc hiệu :KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Đo OD tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Kết quảNếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệuquang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúpphát hiện KN cần kiểm tra.Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondaryantibody) được gắn với enzyme thông qua các liênkết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học(bioconjugation),KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấpnày.Enzyme sử dụng thường là :+ Peroxidase+ Beta – galactoxidase+ Alkaline phosphataseCơ chất (subtrate) là:+ ODP: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm cómàu vàng nhận bước sóng 492 nm ( bằng máy đọc elisa)+ TMB: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm cómàu xanh bước sóng 370-652nm chuyển màu vàng 450nm Enzyme sử dụng trong phương pháp elisa Enzyme ở đây được sử dụng để xác định hỗn hợp khángnguyên – kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Tacó thể sử dụng máy so màu quang điện, huỳnh quang để xácđịnh phản ứng. Enzyme alkaline phosphate Enzyme này được sử dụng trong phản ứng miễn dịch.Người ta thường sử dụng enzyme này với hoạt tính2500UI/mg, ở nhiệt độ 37oC. Để xác định hoạt tính alkaline phosphate có thể sử dụngmáy huỳnh quang với 4 – methylumbeliferyphosphate làmcơ chất ß- galactosidase Người ta thường sử dụng enzyme này có hoạt tính riêng lớnhơn 250UI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl- ß-galactosidase,ở 37oC Hoạt tính của ß-galactosidase được đo bằng máy quangđiện với 4-methylumbelliferyl- ß-galactosidase. Ngoài ra ta cóthể sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ß-galactosidase Horseral peroxidase Enzyme này chứa hai đến ba nhóm hoạt động amine trongphân tử và chứa 12-14.5% carbohydrate. Xác định hoạt tínhenzyme này bằng máy quang điện. cơ chất thường sử dụnglà chromogen-2,2’-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-sulfonate](ABTS) và peroxidase có hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25oC Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là3,3’;5,5’-tetramethyl benzidineThiết bị sử dụngKhay nhựa 96 giếngThiết bị sử dụng Máy đọc elisa (máy quang phổ có các bước sóng khác nhauThiết bị sử dụng Micropipette Micropipette tipsThiết bị sử dụng Máy rửa khay nhựa Micropipette multi tips Ưu điểm phương pháp elisa+Dễ thực hiện+ Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu+ Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgENhược điểm+ Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h)+ Thiết bị mắc tiềnELISA TRỰC TiẾPđịnh các kháng nguyên chưa biết vào các giếng Bước “blockin” “Rửa”hêm kháng thể có gắn enzyme “Rửa” Ghi nhận sự thay đổi Thêm cơ chất ( màu, huỳnh quang, OD…)1. Elisa trực tiếpPhát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus.Áp dụng:- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng.- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh gi ...