Giáo trình Công nghệ Protein part 7

Tham khảo tài liệu giáo trình công nghệ protein part 7, khoa học tự nhiên, công nghệ sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình Công nghệ Protein part 776 Các phương pháp chiết rút tinhChương 5 sạch và xác định protein I. Khái niệm Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự dotrong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tếbào. Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếuta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạchchúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứuprotein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn đượccập nhật và hiện đại hóa. II. Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thể Các phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên nhữngtính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòatan... của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tửsinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bảnchất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cảtính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau. 2.1. Nhiệt độ Để tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người tacó thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt.Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzymebền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 700C trong thời gianxác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọchoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thunhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp. Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuậnnghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối vớidung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 00C tránh biến tính đặc biệtlà protein enzyme. 2.2. Nồng độ proton (pH) Protein là các chất lưỡng tính, vì vậy, trong các dung dịch acid vàkiềm chúng sẽ bị phân ly như sau: 75 Kiềm Protein - COO- + H+ Protein - COOH acid acid Protein - NH3+ Protein - NH2 Kiềm Do các acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhómchức tự do dưới dạng các ion hóa là nguyên nhân tạo ra tính đa điện củaprotein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗipolypeptide không đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗibên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxylcủa amino acid, OH của Tyrosine, - NH2 của lysine, guamidin củaArginine, inidazol của histidine) Mức độ ion hóa của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Cácnhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ởdạng cation trong môi trường acid. Như vậy, ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điệntích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhómtích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cốđịnh, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau.Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặctính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm)cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein cómột giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dươngtrong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein.Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đốivới các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với cácacid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độhòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chấtnày, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp. Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc táchchiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụngcủa pH của môi trường. Dịch protein enzyme được giữ ở pH 5 trong thờigian xác định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng cách lọchoặc ly tâm. Ví dụ citochrom C cũng tan trong acid trichloracetic trong khiđó acid này làm kết tủa phần lớn protein. Như vậy các protein bền với acidcó thể được tách chiết bằng cách này. 76 2.3. Tác nhân hóa học Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiếtcác protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độhòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điệntrong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sựhydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein enzyme cácdung môi hữu ...