Nghiên cứu phát triển bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najia atra

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và tối ưu hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên in vitro.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu phát triển bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najia atraTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT ELISAĐỊNH LƢỢNG NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRAHà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**; Nguyễn Trung Nguyên***Phùng Thế Hải**; Nguyễn Đặng Dũng**TÓM TẮTMục tiêu: xây dựng bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Việt Nam(Naja atra). Đối tượng và phương pháp: bộ xét nghiệm ELISA sử dụng huyết thanh kháng nọcrắn N.atra đặc hiệu từ ngựa và thỏ; tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, xác địnhngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của bộ xét nghiệm. Kết quả: ngưỡng phát hiện (LOD)của bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang N.atra là 0,87 ng/ml, giới hạn định lượng(LOQ) là 1,27 ng/ml; bộ kít đạt yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định và độ đúng.* Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; ELISA.Development of Quantitative ELISA Test Kit for the Detection ofChinese Cobra (Naja atra) VenomSummaryObjective: To develop an ELISA test for venom quantitation in clinical samples of snakebitevictims by Chinese cobra (Naja atra). Materials and methods: An ELISA testkit (developed usinghorse and rabbit sera specific to N.atra venom) was optimized for reaction conditions, as well aslimit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ). Results: LoD and LoQ values of the test forwere 0.87 ng/ml and 1.27 ng/ml, respectively; the test was primarily qualified for analyticalsensitivity, reproducibility and accuracy.* Key words: Venom; Naja atra; ELISA.ĐẶT VẤN ĐỀVới nạn nhân rắn độc cắn, việc đánhgiá mức độ nhiễm độc có giá trị hỗ trợcho việc theo dõi tiến triển bệnh nhân(BN), chỉ định điều trị bằng huyết thanhkháng nọc đặc hiệu và tiên lượng bệnh.Tuy nhiên, việc phân mức độ nhiễm độcđối với nạn nhân rắn độc cắn nói chung,với rắn Hổ mang nói riêng chủ yếu dựavào kinh nghiệm lâm sàng của bác sỹđiều trị nạn nhân rắn độc cắn. Do vậy,có sự khác nhau giữa các trung tâmđiều trị nạn nhận rắn độc cắn. Xét nghiệmxác định nọc rắn định tính và định lượngđược xem là cơ sở khoa học khách quan,* §¹i häc Y Th¸i B×nh** Häc viÖn Qu©n y*** BÖnh viÖn B¹ch MaiNgười phản hồi (Corresponding): NguyÔn §Æng Dòng (dzungmd@yahoo.com)Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015Ngày bài báo được đăng: 28/01/201538TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015giúp phân loại mức độ nhiễm độc nọc rắntrên lâm sàng. Dựa trên kết quả định lượngnồng độ nọc rắn trong máu nạn nhân, đốichiếu với sự xuất hiện và mức độ biểu hiệncủa một số triệu chứng, bác sỹ điều trị cóthể đánh giá một cách khách quan hơnmức độ nhiễm độc nọc rắn và đặc biệt, cóthể chỉ định và/hoặc điều chỉnh liều sửdụng huyết thanh kháng nọc đặc hiệucho nạn nhân. Kỹ thuật ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) là phươngpháp phân tích miễn dịch dựa trên tươngtác giữa kháng nguyên và kháng thể, vớimột số ưu điểm đáng kể là độ nhạy phântích cao, tương đối dễ thực hiện, thời gianthực hiện không kéo dài, có thể thực hiệnđồng thời với nhiều mẫu hoặc thực hiệntừng mẫu thử. Trong nghiên cứu này,chúng tôi tiến hành xây dựng và tối ưuhóa những điều kiện chủ yếu cho một hệthống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắnHổ mang Naja atra trên in vitro.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Vật liệu nghiên cứu.* Sinh phẩm, hóa chất:- Nọc rắn Hổ mang miền Bắc (Naja atra).- Kháng thể IgG ngựa kháng nọc rắnHổ mang Naja atra (Đài Loan), kháng thểIgG thỏ kháng nọc rắn Hổ mang Naja atra(Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y),kháng thể kháng IgG thỏ gắn enzym (Thermo).- Các hóa chất: OPD, gelatin, PBS...(Hãng Sigma và Merck).* Dụng cụ, thiết bị:- Micropipette và đầu côn các loại: 2 µl,10 µl, 20 µl, 200 µl, 1.000 µl.- Pipet đa kênh loại 100 - 300 µl.- Phiến ELISA 96 giếng (Corning).- Tủ ấm.- Máy đo mật độ quang DTX 880(Beckman Coulter).2. Phương pháp nghiên cứu.* Nguyên lý phản ứng:Hình 1: Sơ đồ thiết kế và các bước tiến hành phản ứng ELISA.39TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀBÀN LUẬNThiết kế phản ứng dựa dựa trênnguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich(hình 1), trong đó kháng thể thứ nhất (KT1)là kháng thể IgG đặc hiệu với nọc rắn Hổ1. Xác định các điều kiện tối ưu củaphản ứng.mang Naja atra (sử dụng làm kháng thể bắtgiữ), gắn cố định trên bề mặt giếng phảnứng (pha rắn - solid phase); kháng thể thứhai (KT2 - kháng thể phát hiện) là kháng thểđặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, nhưngcó nguồn gốc khác với kháng thể bắt giữ;kháng thể thứ ba (KT3) kháng thể kháng lạikháng thể phát hiện, được gắn enzymhorse-radish peoxidase (HRP).* Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống ELISAđịnh lượng nọc rắn:- Xác định các điều kiện tối ưu của phảnứng.- Xây dựng đường chuẩn tương quantuyến tính giữa mật độ quang (OD) củadung dịch phản ứng và nồng độ nọc rắnchuẩn.- Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít.- Xác định độ ổn định của bộ kít bằngcách tính toán hệ số biến thiên (CV) giữacác lần thực hiện phản ứng độc lập nhau.- Xác đ ...