Phát hiện đột biến DNA ti thể trong bệnh lý thần kinh thị giác di truyền Leber bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Nội dung của bài viết trình bày về bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER - một rối loạn di truyền ti thể gây mất thị lực hoàn toàn mà không gây đau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện đột biến DNA ti thể trong bệnh lý thần kinh thị giác di truyền Leber bằng kỹ thuật giải trình tự gen Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TI THỂ TRONG BỆNH LÝ THẦN KINH THỊ GIÁC DI TRUYỀN LEBER BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Hoàng Hiếu Ngọc*, Phạm Hùng Vân**, Huỳnh Viết Lộc** TÓMTẮT Đặt vấn đề: Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER là một rối loạn di truyền ti thể gây mất thị lực hoàn toàn mà không gây đau. Bệnh do những đột biến điểm trong DNA ti thể làm thay đổi protein thuộc chuỗi vận chuyển điện tử thuộc ti thể. Mục tiêu: Phát hiện các điểm đột biến trong DNA ti thể thường gặp như G11778A, T14484C, G3460A trong DNA ti thể của người bằng cách giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Phương pháp: DNA của những bệnh nhân bị giảm hoặc mất thị lực hoàn toàn được tách chiết từ mẫu máu toàn phần. Sau đó, dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại từng vùng gen có chứa các điểm đột biến thường gặp. Sản phẩm khuếch đại sau đó được giải trình tự trực tiếp bằng bộ kit BigDye®Terminator. Phân tích kết quả giải trình tự bằng cách so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn để phát hiện điểm đột biến. Kết quả: Từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012 chúng tôi thu thập được 37 ca nghi ngờ bệnh LHON. Trong đó phát hiện được 18 trường hợp có đột biến DNA ti thể, 14 trường hợp mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thường gặp nhất, 8 trường hợp còn lại mang đột biến T14484C. Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON; đồng thời mở ra một hướng nghiên cứu mới đối với các bệnh di truyền theo DNA ti thể. Từ khóa: bệnh Lebel, đột biến DNA ti thể, LHON, PCR ABSTRACT DETECT MUTATION IN MITOCHONDRIAL DNA IN PATIENTS WITH LEBER’S HEREDITARY OPTIC NEUROPATHY BY GENE SEQUENCING Hoang Hieu Ngoc, Pham Hung Van, Huynh Viet Loc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 81 - 85 Background: Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is a mitochondrial inherited disorder that causes completely loss vision without pain in healthy adults. This disease caused by point mutations in human mitochondrial DNA that lead to change protein in the electron transfer chain of the mitochondria. Objective: Detecting highly prevalent mutation points such as G11778A, T14484C, G3460A in human mitochondrial DNA by direct sequencing PCR products. Method: Patients’ DNA were extracted from whole blood samples and then perform PCR reactions of which primers designed to amplify DNA fragments that include mitochondrial point mutations. Amplified products will be sequenced directly by using BigDye®Terminator kit. Analyse results to detect point mutations of patients. Result: From 08/2011 to 12/2012, we have 37 patients who loss vision without pain. There are 18 cases which have point mutations; 14 cases have severe point mutation of G11778A and the last four cases have point * Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM , ** Công ty Nam Khoa Tác giả liên lạc: ThS. BS. Hoàng Hiếu Ngọc ĐT: 0988937406 Email: hoanghieungoc@yahoo.com Mắt 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 mutation of T14484C. Conclusion: By using PCR and gene sequencing, we build up the examination to detect point mutations in LHON successfully. Since, we open up the new trend of research mitochondrial inherited disorders in Vietnam. Keywords: Lebel, mutations in mitochondrial DNA, LHON, PCR. chung một cách chính xác và nhanh chóng; từ đó ĐẶT VẤNĐỀ mở ra thêm những hướng nghiên cứu mới về Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER bệnh di truyền tại Việt Nam. được xác định về mặt lâm sàng là do teo thần ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU kinh thị giác gây mất thị lực trung tâm(7). Bệnh thường xuất hiện ở nam trong độ tuổi 20 – Mẫu bệnh phẩm 40(7,8) nhưng cũng có thể xuất hiện ở độ tuổi từ Mẫu máu toàn phần chống đông bằng 5 đến 65(8,2). Triệu chứng bệnh thường gặp là EDTA của những bệnh nhân nghi ngờ bệnh mất thị lực trung tâm cấp hoặc bán cấp ở LHON hoặc cần được chẩn đoán phân biệt với người trẻ đôi khi các triệu chứng về thần kinh, các bệnh gây xơ hóa võng mạc khác. tim mạch và cơ xương cũng đi kèm. Nam giới Trích biệt DNA bạch cầu từ máu toàn phần mắc bệnh chiếm đến hơn 80% các trường hợp chống đông bằng EDTA bệnh(2). Nguyên nhân gây bệnh được xác định Chúng tôi sử dụng bộ tách chiết DNA bằng là do đột biến DNA của ti thể thuộc các vùng kit thương mại QIAGEN DNA Blood Mini kit. gen ND (mitochondrial encoded NADH Phương pháp tách chiết DNA được thực hiện dehydrogenase genes) là mtND1, mtND2, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 200 µl mtND3, mtND4, mtND4L, mtND5, mtND6 máu toàn phần cho vào 1 tube Eppendorf, lần gây thay đổi các protein thuộc phức hợp I của lượt cho vào tube 20 µl proteinase K và 200 µl chuỗi hô hấp tế bào(9). Các nghiên cứu về bệnh AL buffer. Lắc trộn mẫu thật kỹ trong 15 giây ...