Nghiên cứu ứng dụng quy trình phát hiện SNP RS9263726 để sàng lọc alen HLA-B58 01 bằng phương pháp PCR RFLP

Mục tiêu của bài viết nhằm ứng dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801 thông qua marker SNP rs9263726 (110G>A) bằng kỹ thuật PCR-RFLP để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng trên BN sử dụng allopurinol.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu ứng dụng quy trình phát hiện SNP RS9263726 để sàng lọc alen HLA-B58 01 bằng phương pháp PCR RFLP TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN SNP RS9263726 ĐỂ SÀNG LỌC ALEN HLA-B*58:01 BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP Ngô Trường Giang*; Trần Văn Khoa* Nguyễn Minh Tâm*; Trần Thị Thu Huyền* TÓM TẮT Mục tiêu: ứng dụng quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP. Đối tượng và phương pháp: 36 mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại alen HLA-B được tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng PCR-RFLP xác định kiểu gen của SNP rs9263726, điện di sản phẩm trên gel agarose 2% và phân tích kết quả để kết luận kiểu gen, giải trình tự gen PSORS1C1 10% số mẫu để kiểm chứng quy trình. Kết quả: trong 36 mẫu AND, sàng lọc được 5 mẫu dương tính với HLA-B*58:01. Kết luận: đã ứng dụng được quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP. * Từ khóa: HLA-B*58:01; rs9263726; PCR-RFLP. Applying a Protocol to Detect SNP RS926726 for Screening HLAB*58:01 Allele Using PCR-RFLP Technique Summary Objectives: Applying a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using PCR-RFLP technique. Subjects and methods: 36 blind blood samples with unknown HLA-B allelic types, total DNA was extracted, SNP rs9263726 was detected using PCR-RFLP technique, electrophoresis PCR products in 2% agarose gel and analysis, sequencing 10% samples. Result: We were able to detect HLA-B*58:01 in 5 of 36 samples. Conclusion: We have applied a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using PCR-RFLP technique. * Key words: HLA-B*58:01; PCR-RFLP; rs9263726. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản ứng thuốc thể nặng ngày càng giảm nhờ nguyên tắc dùng thuốc được hoàn thiện theo hướng cá thể hoá. Tuy nhiên, số lượng các dược chất được đưa vào điều trị lâm sàng ngày càng tăng. Khi phản ứng thuốc nặng xảy ra, tỷ lệ bệnh nhân (BN) tử vong khá cao (30%). Do đó, dự phòng phản ứng thuốc thể nặng vẫn còn là một vấn đề rất đáng quan tâm. Hiện nay, một số kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được sử dụng như marker để phát hiện phản ứng thuốc nặng như: * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Ngô Trường Giang (legiangngo@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/05/2018 Ngày bài báo được đăng: 09/06/2018 37 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 hội chứng Stevens Johnson hay nhiễm độc hoại tử. Trong các HLA này, HLAB*58:01 là một marker di truyền có liên quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể nặng khi dùng thuốc allopurinol, đặc biệt ở cộng đồng người châu 3 . Do đó, cần sàng lọc HLA-B*58:01 trước khi dùng allopurinol để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng do thuốc. Tuy nhiên, việc phát hiện trực tiếp HLA-B*58:01 đòi hỏi máy móc hiện đại, tiêu tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Gần đây, các nghiên cứu đã phát hiện một số SNP liên kết khá chặt với HLA-B*58:01 [2]. Trong số đó, SNP rs9263726 (110G>A) trên gen PSORS1C1 liên kết hoàn toàn với HLA-B*58:01. Do đó, có thể phát hiện HLA-B*58:01 thông qua SNP này. PCR-RFLP là một kỹ thuật đơn giản, dễ triển khai, thời gian cho kết quả nhanh, giá thành rẻ và khá hiệu quả để phát hiện SNPs. Trước thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu: Ứng dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801 thông qua marker SNP rs9263726 (110G>A) bằng kỹ thuật PCR-RFLP để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng trên BN s dụng allopurinol. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. 36 mẫu máu chưa biết loại alen HLAB, chống đông bằng EDTA thu thập tại Học viện Quân y. 2 mẫu ADN đã biết trước kiểu gen của SNP rs9263726 bằng phương pháp giải trình tự Sanger sử dụng làm chứng âm (GG) và chứng dương (GA). 38 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Tách chiết ADN tổng số từ 36 mẫu máu thu thập được: tách chiết bằng kít tách chiết ADN từ máu toàn phần của Qiagen. * PCR-RFLP phát hiện gen HLAB*58:01: - Khuếch đại gen PSORS1C1: trình tự các cặp mồi tham khảo theo Kaiko và CS (2012) [5]. Thành phần phản ứng PCR nhân gen: master mix: 12,5 μl; primers (10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: 7 μl; mẫu: 5 μl, tổng thể tích 25 μl. Chu trình nhiệt phản ứng PCR: trong 5 phút; tiếp theo 30 chu kỳ: trong 30 giây, 600C trong 60 giây, trong 30 giây. Cuối cùng 720C 5 phút. 940C 940C 720C trong Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, phân tích kết quả. * X lý enzym giới hạn: - Các mẫu có kết quả nhân gen PSORS1C1 được xử lý cùng enzym Fok1. - Thành phần hỗn hợp xử lý enzym: sản phẩm nhân gen: 5 μl; enzym Fok1: 0,4 ui. - Chu trình nhiệt xử lý enzym: ủ hỗn hợp ở 37oC trong 2 giờ, bất hoạt enzym ở 65oC trong 20 phút. Sản phẩm thu được điện di trên gel agarose 2%, phân tích kết quả. * Giải trình tự Sanger: sản phẩm nhân gen PSORS1C1 được tinh sạch, giải trình tự Sanger. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả nhân gen PSORS1C1. Sản phẩm nhân gen được điện di trên gel agarose 2% trong 30 phút: H ...