Biểu hiện và tinh sạch amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4

Để phục vụ mục đích nghiên cứu mức độ biểu hiện trong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 của gen mã hóa amidase khuếch đại từ DNA hệ gen của vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, chúng tôi đã tiến hành biểu hiện và tinh sạch amidase tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli chủng BL21 DE3. Protein - enzyme amidase ở vi khuẩn này được mã hóa nhờ đoạn gen có kích thước 1038 bp đã được giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Biểu hiện và tinh sạch amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4Nguyễn Hà Thu và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ184(08): 35 - 40BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH AMIDASE ALIPHATICTỪ Rhodococcus erythropolis PR4Nguyễn Hà Thu1*, Nguyễn Xuân Vũ1, Phạm Bằng Phương1,21Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên2Viện Khoa học Sự sống – ĐH Thái NguyênTÓM TẮTĐể phục vụ mục đích nghiên cứu mức độ biểu hiện trong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 của gen mãhóa amidase khuếch đại từ DNA hệ gen của vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, chúng tôi đãtiến hành biểu hiện và tinh sạch amidase tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli chủng BL21 DE3.Protein - enzyme amidase ở vi khuẩn này được mã hóa nhờ đoạn gen có kích thước 1038 bp đãđược giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111. Sau khi thiết kếmồi và khuếch đại thành công đoạn gen, chúng tôi tiến hành tách dòng trên E. coli DH5α và biểuhiện trên E. coli BL21 DE3 thông qua 2 loại vector tương ứng là pGEM-T và pET28a. Enzymeamidase có kích thước xấp xỉ 38 kDa được biểu hiện tối ưu ở điều kiện nuôi cấy 37 oC, nồng độchất cảm ứng IPTG 1 mM trong thời gian 4 h. Sử dụng cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High Q(BIO-RAD) và cột superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare), chúng tôi đã tinh sạch được amidasetái tổ hợp từ dịch chiết tế bào.Từ khóa: Amidase; Escherichia coli; Acrylamide; Enzyme tái tổ hợp; Vector biểu hiệnMỞ ĐẦU*Amidase (EC 3.5.1.4) được tìm thấy bởiMohamed S. và cộng sự vào năm 1994, cókích thước xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằngSDS-PAGE) và điểm đẳng điện được ướctính là pH 4.0. Trình tự aa N-terminal củaenzyme này được công bố như sau: M R H GD I T S S P D T V G V A V [7].Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quátrình thủy phân amit giải phóng các axit vàamoniac tương ứng [6]. Enzyme này có thểđược phân thành hai loại theo đặc tính bề mặtcủa chúng [2], loại thứ nhất bao gồm cácamidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạchngắn, loại thứ hai là các amidase thủy phânchuỗi amit mạch trung bình, acrylamide vàheterocyclicamide như isobutyramide vàvaleroamide [3]. Đến nay, đã có hơn 26 loạiamidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sànglọc và xác định [5]. Hầu hết trong đó, amidasetồn tại ở loại thứ hai.Amidase được ghi nhận là có mặt thườngxuyên ở chi Rhodococcus. Theo nghiên cứugần đây của Z. Xue và cs (2011) [6], amidasetái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn*Tel:01643 326153, Email: thunguyenty43@gmail.comRhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩnđặc trưng thuộc nhóm Actinobacteria có khảnăng biểu hiện đầy đủ hoạt tính của amidaseđặc biệt là khả năng tổng hợp chọn lọc bất đốixứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổibật là một số chất gây độc cho tế bào nhưacetamide, propionamide, acrylamide, vàbenzamide). Đồng thời trong vi khuẩn này,gen mã hóa amidase có kích thước 1038 bpđã được giải trình tự một cách đầy đủ vàcông bố trên ngân hàng gen với số hiệuACNO01000111 từ nucleotide số 543918đến nucleotide 544955 [7].Amidase là loại enzyme thương mại có nhiềuứng dụng quan trọng trong các ngành côngnghiệp, cụ thể là trong các quy trình liên quanđến quản lý và xử lý chất thải có chứaacrylamide, mặt khác sau khi thủy phân,amidase tạo ra một số axit cacboxylic và dẫnxuất amit có nhiều ý nghĩa quan trọng ứngdụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệpdược phẩm [4].Do có nhiều tiềm năng quan trọng trong cácngành công nghiệp, amidase đã được đầu tưnghiên cứu rộng rãi ngay từ khi được pháthiện. Nhưng khi nhu cầu ứng dụng trong côngnghiệp ngày càng tăng cao thì cần có nhiều35Nguyễn Hà Thu và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆnghiên cứu tập trung và triệt để nhằm nângcao năng suất và hoạt tính amidase thông quakhuếch đại gen và biểu hiện amidase tái tổhợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khuếch đạiđoạn gen mã hóa amidase bằng kỹ thuật PCRtừ chủng vi khuẩn Rhodococcus erythropolisPR4, chọn dòng bằng vector pGEM T-easy,biểu hiện qua vector pET28a trong vi khuẩnE.coli và tinh sạch nhờ vào hệ thống sắc kýion Macro-Prep High Q (BIO-RAD).VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệu:- Mồi:Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu đểkhuếch đại gen amidase aliphatic (amiE).Trình tự mồi được thiết kế dựa vào trình tựgen amiE của Rhodococcus erythropolis PR4đã công bố trên ngân hàng gen (Genbank) vớivới số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số543918 đến nucleotide 544955, được đặt muatừ công ty Genotech.Hai mồi mỗi đoạn dài 27 bp được thiết kế như sau:Mồi xuôi amiE-F (EcoRI): GAATTC ATGCGA CAC GGT GAC ATC TCC.Mồi ngược amiE-R (SalI): GTCGAC TTAAAC TTC GAT TGT CTT CTC.- Chủng giốngVi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4được phân lập từ nước biển Thái Bình Dươngdo trung tâm NITE Biological esource NhậtBản cung cấp.Vi khuẩn E. coli DH5α, JM109 dùng cho táchdòng và E. coli BL21 DE3 PlysS dùng chobiểu hiện do Viện Khoa học Sự sống – Đạihọc Thái Nguyên cung cấp.Vector tách dòng pGEM-T easy thương mạiđược cung cấp bởi Promega; vector biểu hiệnpET28a thương mại được ...