Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen coat protein của virus SMV và BYMV

Trong bài viết này, chúng tôi trình bày kết quả thiết kế cấu trúc vector RNAi mang đoạn gen coat protein (CP) của SMV và BYMV nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus. Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen coat protein của virus SMV và BYMVTẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAiCHỨA VÙNG GEN COAT PROTEIN CỦA VIRUS SMV VÀ BYMVLò Thị Mai Thu1, Phạm Thanh Tùng2, Lê Văn Sơn2,Chu Hoàng Hà2, Chu Hoàng Mậu3*1Trường Đại học Tây BắcViện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam3Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên; *mauchdhtn@gmail.com2TÓM TẮT: SMV và BYMV là hai loại virus điển hình gây bệnh khảm lá ở đậu tương, hiện nay, trongngành sản xuất đậu tương mới dừng lại ở các biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị hai loại virus này.RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật, tínhhiệu quả của kỹ thuật RNAi thể hiện ở việc tạo cây trồng kháng virus bằng cách chuyển các gen có nguồngốc từ chính virus gây bệnh. Với mục đích cải thiện khả năng kháng virus SMV và BYMV của cây đậutương Việt Nam bằng kỹ thuật chuyển gen, trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả thiết kếvector chuyển gen (pGWSMV-BYMV-CPi) mang cấu trúc RNAi-CPi của SMV và BYMV. Đoạn CPi làtrình tự bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV có kích thước 573 bp. Tạo được dòng vi khuẩn A.umefaciens mang cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi sử dụng để lây nhiễm vào mô tổn thương nách lá mầmnhằm tạo các dòng cây đậu tương chuyển gen kháng virus SMV và BYMV.Từ khóa: Bệnh khảm lá, BYMV, đậu tương, gen CP, SMV.MỞ ĐẦUKết quả điều tra về bệnh trên cây trồng ởViệt Nam đã xác định được 20 loại bệnh hại,trong đó, các bệnh do nhiễm virus đã gây tổnthất lớn cho năng suất đậu tương và hiện nayvẫn chưa có biện pháp phòng trừ hiệu quả cácbệnh do virus. Đậu tương là một trong số cáccây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnhkhảm (soybean mosaic virus-SMV), bệnh khảmvàng (bean yellow mosaic virus-BYMV), bệnhxoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác. Vìvậy, nghiên cứu tạo cây đậu tương kháng virusphục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương sạchbệnh là rất cần thiết.SMV và BYMV thuộc chi Potyvirus, họPotyviridae. Hệ gen của SMV và BYMV baogồm các gen trên sợi RNA (+). Bệnh khảm ládo SMV và BYMV là một trong những bệnhvirus điển hình nhất ở đậu tương, làm giảmnăng suất và chất lượng của hạt đậu tương.SMV và BYMV lan truyền do rệp làm môi giớivà sự lan truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ dorệp ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu. Hiện nay trongngành sản xuất đậu tương mới dừng ở các biệnpháp phòng mà chưa có thuốc trị hai loại virusnày. Đó là chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống,vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thudọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng và diệt trừcôn trùng truyền bệnh. Các biện pháp truyềnthống thường phức tạp, tốn thời gian, hiệu quảkhông cao và kém bền vững. RNAi được xem làmột kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại cácbệnh do virus gây ra ở thực vật. Tính hiệu quảcủa kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồngkháng virus bằng cách chuyển các gen có nguồngốc từ chính virus gây bệnh [1, 2, 3] và khẳngđịnh sự kết hợp với kỹ thuật chuyển gen là biệnpháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việccải thiện và tăng cương khả năng kháng virus ởcây trồng [12]. Trong bài báo này, chúng tôitrình bày kết quả thiết kế cấu trúc vector RNAimang đoạn gen coat protein (CP) của SMV vàBYMV nhằm phục vụ tạo cây đậu tươngchuyển gen kháng virus.VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệuVùng gen CPi của SMV và BYMV có kýhiệu SMV-BYMV-CPi với kích thước 573nucleotide được thiết kế bao gồm đoạn bảo thủcủa gen CP ở SMV và BYMV dựa trên phântích đoạn gen CP của SMV và BYMV đã phânlập và các trình tự được công bố trên Gen Bank.129Lo Thi Mai Thu et al.Cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R choPCR nhân bản đoạn CPi được thiết kế có trìnhtự: SMV-CPi-F: 5’- caccgcagcagaagcttaca -3’và BYMV-CPi-R: 5’- atgttccgaaccccaagcaa -3’.Vector chuyển gen pK7GWIWG2(II), bộ kitnhân dòng pENTRTM Directional TOPO®Cloning Kit (Invitrogen), bộ kit thực hiện phảnứng Gateway Gateway® LR ClonaseTM II.Chủng vi khuẩn E. coli One Shot® TOP 10(Invitrogen), E. coli DH5α và chủngA. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độcpGV2660.Thiết kế vector chuyển gen thực vật mangcấu trúc RNAiKỹ thuật Gateway (Invitrogen, Karlsruhe,Germany) được sử dụng để tạo cấu trúc RNAidựa trên nguyên lý trao đổi chéo đặc hiệu vị trícủa phage λ.Thiết kế vector chuyển gen thực vật mangcấu trúc RNAi được thực hiện theo mô tả củaKarimi et al. (2002) [5] (hình 1).Sản phẩm PCR được tinh sạch bằngGeneJET PCR Purification Kit của hãngThermo Scientific. Sau khi tinh sạch, đoạn genCPi tiếp tục được dòng hóa vào vectorpENTRY/D để tạo ra dòng entry pENTR/Dmang CPi (kí hiệu pEN-CPi) có chứa các vị trítái tổ hợp attL. Đây là vị trí sẽ tái tổ hợp vớiattR trên pK7WIWG2(II) khi có sự xúc tác củaenzyme đặc hiệu. Tiếp đó phản ứng LR (phảnứng xảy ra sự tái tổ hợp giữa các vị trí attL vàattR được xúc tác bởi enzyme LR ClonaseTMII)được thực hiện giữa vector pEN-CPi với vectornhận destination pK7WIWG2(II). Kết quả sẽtạo được vector nhị thể biểu hiện ở thực vậtmang cấu trúc RNAi với hai vị trí chèn đoạngen đưa vào theo chiều sene và antiense đượcngăn cách bởi một đoạn intron dưới sự điềukhiển của promoter CaMV35S (ký hiệu:pGWSMV-BYMV-CPi). Cấu trúc pGWSMVBYMV-CPi được dòng hóa trong tế bào E. coliDH5α. Chọn lọc các khuẩn lạc dương tính trênmôi trường LB bổ sung các kháng sinhstreptomycin 40 mg/l, Spectinomycin 100 mg/lvà Chloramphenicol 50 mg/l. Sau khi chọndòng trong tế bào E. coli bởi phản ứng colonyPCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Tách chiết plasmidpGWSMV-BYMV-CPi và cấu trúc pGWSMVBYMV-CPi được biến nạp vào tế bào A.tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260 bằngphương pháp xung điện. Trước khi biến nạpvector tái tổ hợp pGWSMV-BYMV-CPi vào tếbào A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gâyđộc pGV2260 bằng phương pháp xung điện, tếbào này được làm cho khả biến theo Sambrooket al. (1998) [8].KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNHình 1. Sơ đồ mô tả các bước thiết kế vectormang cấu trúc RNAi bằng k ...