Giáo trình Thực tập Vi sinh vật học: Phần 2

Phần 2 giáo trình "Thực tập Vi sinh vật học" gồm các bài thực hành: Đo sinh trưởng của vi sinh vật, nhu cầu về dinh dưỡng và điều kiện sinh trưởng của VSV, vi khuẩn chỉ thị độ nhiễm bẩn nước, vi sinh vật đất, vi khuẩn lactic và sữa, quan hệ giữa VSV với thực vật và người.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình Thực tập Vi sinh vật học: Phần 2 BÀI 9. ĐO SINH TRƯỞNG CỦA Vi SÌNH VẬT Có thể định nghĩa sinh trưồng là sự tăng số lượng vật chất tế bào. Tuy nhiên cần phân biệt sự khác nhau giữa sinh trưỏng của quần thể (populatỉon grouĩth - sự tăng số lượng hoặc sinh khôi của quần thể) và sự sinh trưỏng của tế bào (cellular groivth - sự tăng kích thước hoặc sinh khôi của 1 tế bào). Sinh trưỏng của v s v thưòng được hiểu là sự sinh trưởng của 1 quần thể tế bào. Trong một hệ thống đóng (không có chất dinh dưdng thêm vào, không có sản phẩm trao đổi chất được rút ra, giống như bình nuôi VSV) sinh trưởng của v s v được đặc trưng bỏi đưòng cong sinh trưỏng bao gồm 4 pha: pha lag, pha log, pha ổn định (stationary phase) và pha tử vong (death phase). Khi đo sinh trưởng của một quần thể tế bào vi khuẩn, việc quan trọng nhất là xác định sự thay đổi về số lượng tế bào có trong môi trường nuôi cấy tại các thòi điểm khác nhau. Số lượng tế bào vi khuẩn được xác định trực tiếp trên phòng đếm vi khuẩn hoặc gián tiếp nhò phép đo độ đục và đếm số khuẩn lạc trên môi trường đặc. Dựa vào số liệu thu được, vẽ đường biểu diễn mổì tương quan giữa số lượng tế bào với thồi gian (đưòng cong sinh trưồng) để xác định sinh trưông của quần thể qua các pha, tính toán sô thế hệ, thời gian thế hệ, tốc độ sinh trưỏng. Để đo sinh trưỏng cùa quần th ể tế bào cồ dạng sợi như nấm mốc, xạ khuẩn, ngưòi ta thưòng sử dụng một số phưđng pháp đặc biệt: xác định trọng ỉượng tưđi hoặc khô (bỉomass), định lượng protein, ADN, ARN hoặc một vài sản phẩm trao đổi chất đặc tnỉng. 78 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH s ố LƯỢNG TỂ BÀO v s v THÔNG DỤNG 9.1. ĐẾM TRỰC TIẾP DƯỚI KÍN H H IỂN V I Phòng đếm Petroff-Hausser được dùng để đếm tế bào vi khuẩn. Phòng đếm hồng cầu (Thoma, Goriaev) được dừng để đếm tế bào nấm men và phần lớn các eucariot đơn bào. Cách sử dụng các loại phòng dếin này là giống nhau. N^guyên tắc chung: đếm số lượng tế bào có trong một đơn vị thể tíc h của phòng đếm từ đó suy ra số lượng tế bào có trong 1 ml, nhán VỐI độ pha loăng dể biết số tế bào có trong dịch ban đầu. Phòng đ«ìm PetroíT-Hausser có 25 ô lớh, khoảng trống giữa phiến kmh và lá kính có chiều cao là 0,02 mm, tổng diện tích là Imm*., tổng thể tích là 0 ,02mm^. 1 cm* (ml) ứng vói 1000 mm* ứng vđi 5.10 lần thể tích phòng đếm. Oách tiến hành: pha loãng và cho mẳu vào phòng đếm, không: để tràn ra ngoài. Đếm số lượng tế bào vi khuẩn có trong vài ô lớn, tính giá trị trung bình (a). Gọi K là độ pha.loãng. sngữ độ đục {turbidity- tính đục) và sử dụng để đánh giá gián tiếp số lượng tế bào. Phép đo độ đục được tiến hành trên máy trực tiếp đọc độ đục (nephelometer) nhưng thông dụng hơn cà là xác định trên máy so màu (colorimeter) hoặc máy đo quang phổ (spectrophotometer) với bước sóng 600- 700 nanomet (nm). Ánh sáng ỏ phạm vi này ít bị hấp thu bỏi các thành phần của tế bào. Do vậy bất cứ sự ngắt quãng dòng ánh sáng đi qua đều là do sự phản chiếu (reflection), không phải là do sự hấp thu (absorption). Sử dụng các bưôc sóng khác sẽ gây sai lệch vì cả hai hiện tượng hấp thu và phản chiếu đều gây nên sự ngắt quãng ánh sáng. Các máy đo độ đục bao gồm nguồn ánh sáng và tế bào quang điện cách ròi nhau bỏi ô đựng mẫu. Dịch h u y ể n phù tế bào trong ô đựng mẫu sẽ cản trở dòng ánh sáng đi qua khiến ánh sang ít bị đập vào tế bào quang điện hđn so vối mẫu trăng (không có tế bào). Chỉ tiến hành đo độ đục khi từng tê bào riêng biệt tham gia vào việc cản trỏ ánh sáng. Lúc cụm lại, các tế bào bên ngoài che chắn một cách hữu hiệu các tế bào bên trong khỏi bị chiếu sáng làm cho phép đo độ đục trỏ nên không chính xác. Vì vậy chỉ tiến hành đo độ đục với các mẫu mà ỏ đó v s v sinh trưởng làm đxỊC đồng đểu môi trưòng nuôi cấy, không tạo thành váng, khuẩn ti hoặc các khôi. Có thể sử dụng phép đo độ đục đôì vối các mẫu có tế bào sinh trưỏng chìm dưổi đáy nhưng không dính vào nhau. Cần lác đều và đo nhanh tarước khi tế bào clùm xuống. Để đo độ đục cần chuẩn bị môi trưòng nuôi cấy trong suốt, không có cặn hoặc các hạt vẩn đục (ví dụ các hạt phosphat magiê được hình thành bỏi muôi phosphat kali và sulphat magiê có trong môi trưòng). Trưôc khi đo có thể hòa tan các hạt vẩn đục bằng cách thêm vài giọt HCỈ đậm đặc vào mẫu. Trong 80 trường hợp môi trưòng nuôi cấy có màu sẫm, trưỏc khi đo độ đục nên li tâm loại bỏ môi trường, hòa sinh khôi tế bào (lớp tủa) trong dung dịch sinh lí hoặc môi trưòng thích hợp nhưng trong suốt và đưa về thể tích ban đầu. Đối vói 1 loại mẫu nên sử dụng 1 loại dung dịch hoặc môi trường nhất định để pha loãng. Thay đổi dịch pha loăng thưòng dẫn đến kết quả sai lệch. Không đưỢc dùng nước cất để pha loãng mẫu vì sự thay đổi áp suất thẩm thấu một cách đột ngột (từ dung dịch dinh dưdng chuyển sang nước cất) có thể làm cho tê bào bị vd, mất tính đục. Mẫu đối chứng (mẫu trắng - blank) phải có tính chất lí hóa giống như mẫu thí nghiệm nhưng không chứa tế bào vsv. Khi xác định số lượng tế bào v s v ...